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诱导型一氧化氮合酶在强啡肽致脊髓损伤中的作用 |
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l cord injury.
MeSH Dynorphin; Nitric oxide; Spinal cord injuries
蛛网膜下腔注射(intrathecal injection, InI)强啡肽A1-17(dynorphinA1-17,Dyn),在强烈镇痛的同时可导致正常动物的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)，并可加重SCI动物的损伤程度［1］。关于Dyn致SCI的机制尚不清楚。我们实验室以往工作表明N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂和Ca2+通道阻断剂均能对抗Dyn致瘫，提示NMDA和Ca2+与Dyn致SCl机制有关［2］。一氧化氮(nitric oxide, NO)在神经、免疫和心血管等多个系统中具有广泛而复杂的生理与病理作用［3］，近来引起普遍关注。诱导型NO合酶(inducible NO synthase, iNOS)受基因转录调控，一旦形成则缓慢持久产生大量NO，在免疫、肿瘤和脑缺血等病理过程具有细胞毒性作用［3，4］。我们曾采用NADPH-黄递酶(NADPH-diaphorase, Nd)组化技术首次观察到Dyn致瘫可诱导脊髓腹角细胞表达NOS［5］。本文采用3H-左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)转化及iNOS原位杂交技术观测Dyn致瘫后iNOS活性和mRNA表达，并探讨iNOS选择性抑制剂氨基胍(aminoguanidine, AG)对Dyn致SCI作用的影响。
材料与方法
(一)动物、手术和药物引入:Wistar 大鼠，雌雄各半，体重(270±15)g，由中日友好临床医学研究所动物室提供。按Yaksh法进行蛛网膜下腔插管［2，6］。给
国家自然科学基金资助(No. 39370786)
药体积10 μL并用生理盐水10 μL冲洗。AG用1 mol/L HCl快速溶解后用0.1 mol/L NaOH调pH至7.4。其余药物均用生理盐水配制。
(二)后肢运动功能测定：根据Faden 8点分级法和Behrmann 5点分级法加以改进［6］。
(三)iNOS活性测定：采用本研究室建立的3H-L-Arg转化法试剂盒测定iNOS活性。
(四)原位杂交：
常规灌注4%多聚甲醛并维持固定1～2 h。取出T11～S3脊髓于4%多聚甲醛中4℃后固定2～4 h。转至20%～30%蔗糖0.1 mol/L PBS防冻液(原位杂交时需高压消毒)中4℃过夜。以InI尖端为中心，向上向下每0.5 cm为一段，横向切取脊髓。为确保形态学的可比性，根据实验设计，沿脊髓双侧或单侧进行纵行切口，将双切口、单切口和未切口脊髓合为一起进行冰冻切片，厚度为40 μm,按A、B、C、D、E连续收集切片于20%～30%蔗糖液中，4℃存放数天内使用，或-20℃冻存数月内使用。
以Acc I酶切iNOS cDNA质粒，回收684 bp的DNA片段，按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明标记探针并检测定量。按以下程序进行飘浮法原位杂交：(1)取出-20℃保存的冰冻切片解冻后，0.1 mol/L PBS 5 min×3～5; (2)0.1 mol/L甘氨酸5 min；(3) 0.4% Triton X-100 15 min(增加膜通透性)；(4)0.1 mol／L PBS 5 min×1～2(消除Triton X-100 对蛋白酶K的影响)；(5)10 g/L蛋白酶K(新鲜配制)37℃ 20～30 min(提高探针穿透性)；(6) 4%多聚甲醛4℃ 5 min(终止蛋白酶K的作用)；(7)0.1 mol/L PBS 5 min×2～3； (8) 0.2 mol/L HCl 10 min(抑制内源性碱性磷酸酶并封闭非特异性结合位点)；(9)2×SSC 10 min(清洗与过渡)；(10)预杂交液(含50%去离子甲酰胺，5×SSC， 10%硫酸葡聚糖，2×Denhardt液，0.5%SDS和0.2 g/L变性鲑精DNA)42～45℃ 1～2 h；(11)杂交液(预杂交液中加入标记探针0.5 mg/L)煮沸10 min骤冷后，取2～3 μL脊髓切片加入Eppendorf管中，盖好后42～45℃ 20 h；(12) 50%甲酰胺/2×SSC 42℃ 15 min×2；(13)50%甲酰胺/0.1×SSC 42℃ 15 min；(上一页 [1] [2] [3] 下一页
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