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异丙嗪对家兔EGTA性发热的解热作用及其机制研究 |
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发热的作用［1，2］，但其降温机制尚不清楚。一些学者强调Ca2＋浓度是体温调定点的生理学基础，并认为其敏感区位于后下丘脑［3］。我们的研究发现［4］，向家兔侧脑室灌注EGTA，降低中枢Ca2＋浓度，可引起家兔明显的发热反应。然而，异丙嗪对家兔EGTA性发热有何影响?其降温机制是否与中枢钙代谢有关?迄今未见文献报道。因此，本研究旨在观察PMZ对家兔EGTA性发热反应及家兔下丘脑细胞［Ca2＋］i的影响。
材料与方法
一、试验试剂和主要仪器：
人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)按文献方法配制［4］。EGTA(ethylene glycol bis(2-aminothyl-ether)tetraacetic acid)，分析纯，美国Feinbiochemica Heidelberg公司产品，实验时用ACSF配制成4 mmol/L(pH 7.4)。胰蛋白酶、Fura－2／AM(用DMSO溶成1 mmol/L后，置－20 ℃避光保存备用)、Triton X－100、trypan blue、盐酸异丙嗪均为美国Sigma公司产品；DMEM培养基购于美国Gibco公司。其它试剂均为国产分析纯。主要仪器有RF－5000型荧光分光光度计(日本 Shimadzu)、3000型二氧化碳培养箱(美国Sheldon)、HL－2型电子微量恒流泵(上海沪西仪器厂)和WRY－B型微机热原测温仪(上海黄海仪器厂)。
二、实验动物：
健康封闭群新西兰兔20只由本院动物所提供，体重2.0～2.7 kg，雌雄不拘，单笼饲养，自由饮水进食。实验室温度保持在21～23 ℃。实验前，家兔置于特制的兔架上，用模拟测温探头的导管经肛门插入10 cm并固定在尾根部，每天4 h，适应3 d，第4 d开始实验。
三、体温测定：
实验时，将测温探头经肛门插入10 cm并固定在尾根部，待体温稳定后，用与测温探头相连的WRY－B型微机热原测温仪测定家兔结肠温度3次(每10 min 1次)，取均数作为基础体温，侧脑室灌注后每10 min测定家兔结肠温度1次，连续观察3 h。
四、侧脑室插管：
参照文献所描述的方法［4，5］，在兔头颅骨APO L4～5，APO R4～5处钻孔，将外径为1 mm的塑料导管插入H5水平，用牙科粘固粉将塑料导管固定在颅骨上，并加热封闭塑料导管的上端，缝合切口，术后肌注青霉素(2万U/kg)3 d。第6 d挑选健康的家兔在清醒的情况下进行侧脑室灌注实验。
五、下丘脑细胞［Ca2＋］i测定：
(一)下丘脑细胞悬液制备及Frua－2／AM负载：参照文献所述的方法［4，6］，迅速断头处死家兔，取下丘脑组织置冰冷的Hepes缓冲的Hanks液((mmol/L：Hepes 20,NaCl 137，KCl 5.0，KH2PO4 0.4,Na2HPO4 0.6，NaHCO3 3.0，CaCl2 1.3，MgSO4 0.4，MgCl2 0.5 ，glucose 5.6；pH7.4)中除去血管和残留血液，转入含0.5 mL冰冷Hepes缓冲的Hanks液的烧杯中剪碎后再移入试管，加适量0.125%的胰酶，置37℃培养箱中20 min。用0.5 mL冰冷的DMEM培养基(含10%小牛血清)终止消化，经200目过筛后1500 r／min 离心5 min，去上清液，沉淀用DMEM培养基悬浮。取少量的细胞悬液用台盼蓝(trypan blue)拒染实验检测细胞存活率在95%以上，调整细胞密度为1×109个／L。在上述细胞悬液中加入Fura－2／AM(终浓度为5 μmol/L)后，将细胞悬液置于5%CO2培养箱中，在37 ℃恒温下孵育50 min。负载后的细胞用Hepes缓冲的Hanks液洗3次。用2.5 mL Hepes缓冲的Hanks 液悬浮细胞备用。
(二)荧光测定［6］：采用RF－5000型荧光分光光度计，其激发光栅为5 nm，发射光栅为10 nm。首先扫描测定Fura－2／AM标准液、负载液及Fura－2／AM与细胞悬液温育后的细胞悬液的荧光光谱。Fura－2／AM进入细胞水解成Fura－2后与Ca2＋结合，其激发波长从380 nm移至340 nm左右，发射波长仍为500 nm。达到上述要求后，观察不同实验条件下荧光强度的变化，用计算机按下式计算［Ca2＋］i：［Ca2＋］i＝k（d）×［（F－Fmin)／（Fmax－F）］。其中，k（d）为Fura－2与Ca2＋反应的解离常数(224 nmol/L)上一页 [1] [2] [3] 下一页
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