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肾上腺髓质素在心血管系统的分布及在心血管功能调节中的作用 |
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ression of AdM mRNA is regulated by ET－1 and AGT.Besides,AdM may act as an inhibitor on DNA synthesis and cell proliferation of SHR VSMCs.
MeSH Adrenal medulla;Muscle，smooth，vascular; Immunohistochemistry
肾上腺髓质素(adrenomedullin,AdM)是1993年发现的一种由52个氨基酸组成的新型的血管活性肽［1］。因其最初是从肾上腺髓质中分离出来的，而且在肾上腺髓质中含量丰富，因此被命名为“肾上腺髓质素”。编码人、大鼠和猪AdM前体的cDNA已经克隆出来［2］，它们所编码的AdM在不同种属之间具有高度的同源性。静脉注射AdM具有舒张血管和持续强烈的降低血压作用［1，2］。侧脑室注射AdM可使血压升高和心率加快［3］。AdM在体内分布广泛。应用放射免疫和Northern blot分子杂交方法证明，血管内皮细胞，肾上腺髓质，心脏，肺，肾，十二指肠和颌下腺等外周组织均含有免疫活性的AdM及其mRNA［1，2］。应用放射免疫，免疫组织化学和分子生物学RT－PCR方法证明，在中枢神经系统中也有免疫活性的AdM及其mRNA的广泛分布［4，5］。另外，在血液中也含有丰富的AdM［1］。因此，AdM可能作为一种心血管局部激素，神经激素和循环激素参与心血管功能的调节。本研究进一步应用免疫组织化学方法证明，在大鼠的外周组织，尤其是心血管系统含有丰富的AdM；在此基础上，应用半定量RT－PCR方法观察了缩血管活性肽ET－1和AGT对血管平滑肌细胞AdM mRNA表达的影响。另外，应用［3H］－TdR掺入和细胞计数观察了AdM对SHR血管平滑肌细胞增殖的影响，以探讨它在SHR血管平滑肌细胞增殖中的意义。
材料与方法
一、免疫组织化学染色：
兔抗大鼠AdM多克隆抗体由美国Phoenix公司提供。免疫组织化学染色试剂盒购自北京华美生物工程公司。
本实验选用的动物为Wistar大鼠，体重250 g，断颈处死后立即取主动脉，心，肝，肾和肾上腺，置于4%多聚甲醛固定液中。固定12 h后，浸蜡包埋，切成10 μm厚的石蜡切片，经透明、脱水后进行染色。免疫染色程序参考Hsu等人所建立ABC免疫组织化学染色方法［6］。第一抗体的稀释度为1∶600。阴性对照片省去一抗。
本实验选用培养的血管平滑肌细胞，内皮细胞和心肌细胞，使细胞爬于盖玻片上，经透明，脱水后进行免疫染色，方法同上。
二、细胞培养：
取6～8周龄的雄性SHR和WKY大鼠和新生小牛的胸主动脉段，分别培养血管平滑肌细胞和内皮细胞。本实验选用5～8代细胞进行实验。取新生3 d的Wistar大鼠乳鼠的心脏，进行心肌细胞原代培养。本实验选用1～3代细胞进行实验。
三、半定量RT－PCR分析：
从培养的大鼠血管平滑肌细胞提取总RNA。采用紫外吸收法进行RNA定量，各组RNA样品的OD260nm／OD280nm吸光度比值均在1.8～2.0之间。将2μg的总RNA反转录成为相应的cDNA。
参照大鼠的AdM前体cDNA核苷酸序列合成正义和反义寡聚核苷酸引物。大鼠AdM前体的正义和反义引物分别为5′－T CGC TAC AGA ATG AAG CTG G－3′(－10～＋10）和5′－AT ACT CGC CCG ACT GTT CAA＋3′（＋573～＋592)，其扩增产物为603 bp。以GAPDH mRNA水平作为内对照，其正义和反义引物分别为5′－TCC CTC AAG ATT GTC CAG CAA－3′和5′－AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT－3′)，其扩增产物为309bp。半定量PCR参照Martin等人建立的方法［7］。PCR反应液中加入18.5×104Bq［α－32P］dCTP。PCR的条件为：94℃变性1 min，56℃退火1.5 min，72℃延伸2.5 min，扩增30个循环。取15 μLPCR产物，在含有溴化乙锭的1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外灯下将相应的PCR产物切下，烤干后放入闪烁液中过夜，然后进行β计数。以AdM cDNA的β计数值与内对照GAPDH cDN上一页 [1] [2] [3] 下一页
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