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内皮素在NG |
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(一)动物模型及分组：实验选用180～200 g雄性Wistar大鼠，随机分为3组，每组10只。(1)L-NAME高血压组：参照Sigmon等方法［2］复制模型，将L-NAME溶于水中(75 g／100 L)喂饲3周。(2)L-NAME+JKC－301组：饮用L-NAME液同第1组，1周后加用JKC－301，尾静脉注射1.34 mg／kg，每日1次，连续2周。(3)对照组：常规喂饲，不作特殊处理。
(二)标品采集：1周时清醒动物尾动脉测压，3周时(停药后24 h)20%乌拉坦(5 mg／kg ip)麻醉，肝素抗凝，颈动脉插管，稳定30 min后生理多导仪(日本光电，AP-611G)记录平均动脉压MABP，然后放血处死动物。收集并分离血浆，称取心脏及左心室(包括室间隔)重量，计算心重／体重(HW／BW，mg／g)、左心室重／全心重(LW／HW，mg／mg)比值。摘取胸腹全长主动脉，各5只动物血管分别进行NOS活性等测定与ET受体结合实验。
(三)血浆NO－2水平测定：将血浆中硝酸盐(NO－3)经镉柱还原为亚硝酸盐(NO－2)，加入Griess液测定血浆NO－2浓度［3］。
(四)血管NOS活性测定：取约50 mg腹主动脉匀浆，制备酶提取液，按我室张新波等［4］报告的方法测定NOS活性，(即［3H］-L-Arg生成H-citraulline值)。考马斯亮兰法进行匀浆蛋白定量。
(五)血浆及血管ET放免活性(ET-ir)测定：取血浆和约10 mg胸主动脉按放射免疫药盒说明书测定ET-ir。(预先经C18柱纯化处理)。
(六)制备血管平滑肌细胞粗制膜，行ET受体结合实验［5］
取动物全长胸主动脉，擦去血管内、外膜，参照Lopez等［6］的方法，血管组织先匀浆，10 000g,20 min离心后取上清再离心(48 000×g,30 min),然后取沉淀匀浆47 800 g 离心30 min再留沉淀混悬于含0.25 mmol葡萄糖、25 mmol Tris、1mmolPMSF(pH7.5)的溶液中，制成血管平滑肌细胞粗制膜，-70℃保存。取细胞膜悬液，分别加入不同浓度的［125I］-ET1(5-800pmol/L),终容量0.25 mL，双平行管30℃孵育30 min,经0.45μm微孔滤膜在Millipore 上抽滤，冷PBS液冲冼，非特异管为1mmol/L ET1,γ计数仪测γ放射活性。总结合减去非特异的ET1受体结合。Scatchard plot 分析计算最大结合(Bmax)与解离常数(Kd)。
实验试剂：JKC-301、ET1(人)、［125I］-ET1由美国phoenix pharm 公司惠赠。L-NAME购自Sigma CO.［3H］-L-Arg为Dupont NEN产品，(229.4×1010Bq／mmol)。
各组实验数据均以±s表示，两组资料组间t检验，多组资料方差分析组间q检验作统计学处理。
结果
一、MABP及HW／BW、LW/HW变化：
口服L-NAME引起大鼠高血压和心肌肥大。与对照组比较，服用L-NAME1周及3周MABP分别增加26%和48%(P＜0.01)；3周后动物HW/BW、LW/HW比值分别增加29%和15%(P＜0.01)。L－NAME＋JKC－301组动物在用JKC－301治疗前(喂L－NAME 1周)L-NAME高血压组相(近P＞0.05)。治疗结束时MABP、HW／BW与LW／HW比值都明显降低(P＜0.01或0.05)。结果见表1所示。
二、血浆NO－2水平与血管NOS测定
L-NAME高血压动物血浆NO－2浓度较对照组低68%，血管NOS活性低70%，(P＜0.01)。JKC-301治疗动物血浆NO－2比单纯L-NAME组口服增加1倍，(P＜0.01)，血管NOS活性亦显著增加(+110%，P＜0.01)见表2。
表1 平均动脉血压和心重量的比较
Tab 1 Comparison of mean arterial blood pressure and heart weight(±s,n=10)
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