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高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖及细胞内游离钙水平的影响 |
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;Insulin;Verapamil
糖尿病患者心血管病的发病率显著高于非糖尿病人群。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖并迁移入内膜在动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用［1］。以往研究表明，VSMC在含高浓度葡萄糖培养液培养后，细胞内出现钙化小球［2］。高胰岛素环境具有促进VSMC增殖的作用［3］。本研究模拟2型糖尿病伴高胰岛素血症状态下VSMC的生长环境，用含与不含维拉帕米(verapamil,Ver)的高浓度葡萄糖加高浓度胰岛素的Dulbecco s modified eagle medium (DMEM)培养液分别培养人血管平滑肌细胞 (human vascular smooth muscle cells，HVSMC)。观察细胞计数及细胞内游离钙水平；了解高糖加高胰岛素对HVSMC增殖的影响及其有关机制。
材料与方法
(一)主要试剂：DMEM(Gibco公司产品)；新生牛血清(FBS，杭州四季青生物工程技术研究所产品)。人胰岛素(美国Eli Lilly公司产品)；Ver(天津中央制药厂产品)；Furo-2／AM(上海生理研究所产品)。
(二)方法：
1.HVSMC培养：按熊静波等［4的人脐动脉平滑肌细胞培养的方法进行，细胞传至第8代时用于实验，实验前细胞经无血清DMEM培养液培养24 h，使细胞均处于静止期。每瓶细胞计数均调整至1×108／L，培养液为含20%FBS的DMEM培养液，每瓶5 mL，各培养瓶中所加试剂(终浓度)见表1，各组样本数为9(n=9)。细胞在CO2孵箱中培养3.5 d。
2.细胞计数：融合细胞层经胰蛋白酶消化后用细胞计数板计数。
3.VSMC内游离钙测定：用Furo-2／AM测定。按文献方法进行［5］。测定前细胞计数调整至3×108／L。用日立F30101型荧光光度计测定荧光值。根据所测静息荧光值(F)、最大荧光值(Fmax)和最小荧光值(Fmin)按公式计算出细胞内游离钙浓度。［Ca2+］i=Kd(F-fmin)／(fmax-F)。Kd常数为224，［Ca2＋］i单位为nmol／L。
(三)统计分析：各组结果以均数±标准差(±s)表示；用t检验对两组间均数进行比较。
结果
不同DMEM培养液培养的HVSMC计数、细胞内游离钙水平及其比较见表1、图1及图2。
从表1、图1及图2可以看出，高糖、高胰岛素及高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于对照组(P＜0.01)。高糖加高胰岛素培养液培养组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于高糖、高胰岛素培养液培养的各组(P＜0.01)。含1 μmol／L Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数和细胞内游离钙水平均显著低于无Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组(P＜0.01)及对照组(P＜0.05)。
Fig 1 Cell count of HVSMCs cultured in different DMEM(±s，n＝9）.Reagents put in DMEM of group 1(control) to group 7 are shown in Tab 1.*P＜0.01，vs group 1,5,6,7;△P＜0.01，vs group 4;▲P＜0.05，vs group 1.
图1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数
表1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数、游离钙水平及其比较
Tab 1 Cell count and free Ca2＋level of HVSMCs cultured in different DMEM(±s，n=9)
Group DMEM Cell count(×108／L) ［Ca2＋］i(nmol／L)
1(control) 5.6mmol／L Glu 3.83±0.61 156.80±18.29
2 27.8mmol／L Glu 6.44±0.88*△ 239.33±31.74*△
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