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嵌合性硫代磷酸修饰的反义c |
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ent and sequence-specific manner. This investigation indicates that c-myc gene product is involved in the signal transduction pathways mediating SMC proliferation and provides a basis for future study of the potential role of antisenese strategy using c-myc AS-ODN designed to inhibit SMC proliferation for the prevention of coronary restenosis.
MeSH Oligodeoxyribonucleotides, antisense; Genes, myc; Muscle, smooth; Cells
经皮腔内冠脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)已成为冠心病的主要治疗手段之一，但术后3～6个月内发生的再狭窄是影响PTCA远期疗效的限制因素，迄今尚无有效防治再狭窄的措施［1］。反义核酸技术是近十年来兴起的技术。它的特异性和负调控靶基因的作用为再狭窄的防治带来了新的希望。
动脉平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)的增殖是再狭窄形成的重要机制之一。c-myc基因表达是SMC从G0／G1期进入S期所必需的。多种引起SMC增殖的生长因子和血清刺激均导致c-myc基因表达增高。本研究采用针对大鼠c-myc mRNA包括AUG在内的翻译起始区的前5个密码子的嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)，通过阳离子脂质体lipofectin导入培养的大鼠SMC，观察其对SMC增殖的影响，以期探索一条抑制SMC增殖进而防治再狭窄的新途径。
材料与方法
(一)试剂：DMEM培养基、lipofectin、HEPES和胰蛋白酶购自GIBCO/BRL公司，胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自中国医科院天津血研所，3H-TdR购自中科院原子能研究所。
(二)ODN的合成和序列：ODN由美国Research公司合成。ODN 5′和3′端各3个磷酸二酯键中的一氧原子被硫取代，其它磷酸二酯键未行修饰。合成的ODN经HPLC纯化，冻干保存。正义(sense)序列5′ATG CCC CTC AAC GTG 3′;反义(antisense)序列5′CAC GTT GAG GGG CAT 3′；错配(mismatch)序列5′ CAC GTG GAG TGG CAT 3′。
(三)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ODN的稳定性：将处于指数生长期的SMC培养上清液(含20%FCS的DMEM)取出，分别在电泳前的不同时间，加入c-myc AS-ODN至SMC培养上清液中，使其浓度达到200 mg/L，置37℃体积分数为5%CO2的孵箱中孵育。电泳时取1μL加入7μL缓冲液，2μL甲酰胺，混匀，于55℃加热5 min，再加2μL缓冲液，混匀，用微量进样器按顺序上样。加样前，先用1500V电压预电泳15 min。切断电流后，加入样品，使用1500V电压进行电泳。电泳结束后取下凝胶。EB染色1 h，紫外灯下观察照相。
(四)SMC的培养：方法参照文献［2］。
(五)［3H］－TdR的掺入实验：方法参照文献［3］。
(六)统计方法：实验数据采用SPSS软件处理，所有计量资料均先行方差分析。若方差齐性，多组之间的两两比较采用q检验；若方差不齐，进行秩和检验，多组之间的两两比较采用推广的t检验。
结果
(一)c-myc AS-ODN在细胞培养上清液中的稳定性：c-myc AS-ODN在细胞上清液中相当稳定，一直到孵育第7天，AS-ODN也没有明显降解，说明本研究所采用的嵌合性硫代磷酸修饰的ODN性能稳定，能够抵抗核酸酶的降解。
(二)c-myc AS-ODN对SMC增殖的抑制：
(1)c-myc AS-ODN对从静止状态刺激的SMC增殖的抑制：将SMC悬液接种上一页 [1] [2] [3] 下一页
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