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汉防己碱对缺血神经元钾通道的作用 |
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元电压依赖性钾通道变化的影响，以进一步阐明Tet对缺血脑保护作用的机制。
材料与方法
一、药品：
Tet(浙江金华制药厂，纯度＞98%)；胰蛋白酶，多聚赖氨酸，四乙胺和N-trimethylsilyldiethylamine均为Sigma产品。
二、大鼠皮层神经元分离：
按参考文献［4，5］分离大鼠大脑皮层神经元。将2～4周龄的Wistar大鼠(雌雄不拘)断头取脑，分离皮层并切成400～500 μm的冠状脑片，在人工脑脊液中孵育0.5～1 h后，用0.1%的胰蛋白酶消化0.5 h，稍加剪碎后用吸管吹打使组织分散，单个细胞游离，将细胞悬液滴加于涂有0.1%多聚赖氨酸的盖玻片上使细胞贴壁。
三、单个细胞缺血模型的建立：
以体积分数为95% N2+5%CO2混合气饱和无糖浴液，通气时间大于1 h。细胞分离后，加入此液体使细胞缺氧缺糖，从而模拟体内的缺血状态。
四、通道电活动记录：
采用细胞贴附式膜片钳技术记录通道电活动［5］，采样频率10 kHz，放大器低频滤波1 kHz，用pClamp软件的Fetchex进行不间断记录，细胞钳制电位-80 mV。细胞浴液成分为(mmol/L)：NaCl 140，KCl 10.8，CaCl2 1.8，MgCl2 1，HEPES 5，glucose10，NaOH调制pH至7.4；无糖浴液除不含葡萄糖外，其余同正常浴液；电极液成分为(mmol/L)KCl 120,EGTA 10, HEPES 10,KOH调制pH至7.4；电极电阻2～4 MΩ。
对照组细胞加入正常浴液，缺血组细胞加入经混合氮气饱和的无糖浴液，记录到缺血状态下钾通道开放后，在浴液中加入Tet，其终浓度分别为7.5，15和30 μmol/L，5 min后记录同一膜片上的钾通道。每组细胞每一药物浓度记录10个膜片。
五、结果分析处理：
用pClamp软件的Fetchan程度对曲线理想化，忽略水平0.01 ms，滤波1 kHz。用pStat程序对通道的开放时间、关闭时间进行指数拟合，对通道开放的电流幅度进行高斯拟合，并求出通道的开放概率。实验结果用±s表示，用单因素方差分析进行统计学处理。
结果
一、正常钾通道的记录：
记录的通道电活动的Ⅰ-Ⅴ曲线如图1所示，此通道有明显的电压依赖性，在负的钳制电位时，通道为外向电流，电流幅度随膜的超极化而增加；在正的钳制电位时，通道的电流方向发生翻转，变为内向电流，其翻转电位约为0 mV。在浴液中加入20 mmol/L的四乙胺后，该通道被明显抑制，部分细胞记录时，在电极液中加入0.1 mmol/L的ATP，通道电活动无明显改变。在-80 mV的钳制电位下，该通道有两个开放状态和一个关闭状态(图2)。
Fig 1 Ⅰ～Ⅴ relationship of potassium channel in rat cortical neurons (pA：amplitude)
图1 大鼠皮层神经元钾通道的Ⅰ～Ⅴ曲线
二、Tet对缺血状态下神经元钾通道的影响：
血气分析(美国IL-1620血气分析仪)结果表明：正常浴液经混合氧气饱和后氧分压为105.2 kPa，无糖浴液在通混合氮气1 h后其氧分压为9.16 kPa。由于该液体不含糖，且氧分压较低，可以模拟体内的缺血状态。
缺血状态下，神经元钾通道的开放时间显著增加，其开放时间常数τ1和τ2分别为(1.855±0.033) ms和(17.464±0.734) ms，通道的开放概率增加到(0.151±0.019)，与对照组相比均有显著差异(P＜0.01)。通道的关闭时间与对照组相比无显著差异，说明缺血对钾通道的关闭状态无影响(见图2)。
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