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茶多酚在体外诱导HL |
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成10 mg.mL-1，分装后置-20℃存放。Nonidet P-40(NP-40):Fluka产品。溴化噻唑蓝四唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide: MTT):Fluka产品。琼脂糖(agarose)：美国BRL产品，bp Marker DNA：华美生物技术公司，其余均为国产分析纯试剂。
二、方法：
(一)MTT还原反应测定肿瘤细胞存活率：参照文献［4］将对数生长期细胞稀释成1×105 cells.mL-1接种于96孔培养板，每孔0.2 mL，接种同时加不同浓度茶多酚处理，每个浓度平行4孔，对照组加等体积培养液，置37℃体积分数为5%CO2培养箱培养，48 h后取出96孔培养板，每孔加入新配制的1 mg.mL-1 MTT 50μL，混匀，置37℃，体积分数为5%CO2培养箱内继续培养4 h，再离心，弃上清液后每孔加200 μL DMSO,振荡10 min，溶解MTT甲月 赞沉淀，用EL309型酶标仪，以570 nm为实验波长，450 nm为参考波长测定其吸收度，按下式计算肿瘤细胞存活率及杀伤率并计算IC50：肿瘤细胞杀伤率=1-肿瘤细胞存活率
(二)细胞DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳：参照文献［5］收集3×106细胞，用含2 mmol.L-1EDTA的PBS洗2次，加0.3 mL TBE缓冲液(Triscl.HCL 45 mmol.L-1，pH8.0，含1 mmol.L-1EDTA)，0.25％NP-40及RNase A(终浓度为1%)，混匀后，37℃保温30 min，再加入Proteinasek(终浓度为1 g.L-1)，37℃继续保温30 min，取上清液45 μL加5 μL上样缓冲液。在1.5%琼脂糖凝胶上电泳(3 V.cm-1)，紫外灯下观察并摄影。
(三)细胞形态学观察：收集适量茶多酚处理后的HL-60细胞，离心沉淀，2.5%戊二醛前固定，0.1 mol/L蔗糖磷酸盐缓冲液清洗，1%锇酸PBS(pH 7.4)后固定(4℃)，丙酮乙醇梯度脱水，Epon812包埋，LKB 8800型超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双层染色，日立H 600透射电镜，摄影。
结果
(一)茶多酚对HL-60细胞毒作用：茶多酚处理HL-60细胞48 h后，仅有近11%细胞成活，茶多酚对HL-60细胞的IC50值为732.2 μg.mL-1。
表1 茶多酚作用于HL-60细胞培养液的pH变化
Tab 1 Changes of pH in HL-60 cells treated with tea polyphenols (±s,n=4)
TP concentration
(mg/L) pH
Untreated with Treated with Treated with TP for
TP TP 48 h
0 6.92±0.01*
62.5 6.95±0.01 6.93±0.08
125 6.89±0.04 6.91±0.04
250 6.91±0.11 6.92±0.05
500 6.94±0.02 6.95±0.08
1000 6.90±0.09 6.89±0.07
2000 6.93±0.13 6.90±0.06
4000 6.89±0.01 6.88±0.10
*P＞0.05，vs treated with TP, TP=tea polyphenols
(二)茶多酚诱导HL-60细胞凋亡-以核小体间DNA降解为标志：Dive等［6］报道，0.15 μmol.L-1喜树碱作用3 h即诱导HL-60细胞凋亡，细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳上显示DNA梯状带型ladder。本文以喜树碱作阳性对照药，发现250 mg.L-1茶多酚作用5 h即诱导HL-60细胞产生类似喜树碱作用后的DNA条带，大小相当于180 bp或180 bp的整倍数，提示茶多酚能诱导HL-60细胞产生凋亡。电泳图1A显示，当茶多酚浓度为250上一页 [1] [2] [3] 下一页
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