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再生障碍性贫血与丙型和戊型肝炎病毒相关性的研究 |
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人进行比较。
材料与方法
一、病例的选择：
1991～1997年间临床已确诊［1］为再生障碍性贫血的患者，分成两组：(A)组为先患丙肝(或戊肝)后患再障，共34例(或25例)，其中男22例(戊肝18例)；女12例(戊肝7例)；年龄14～42岁，平均年龄29.2岁(戊肝28.1岁)。(B)组为先患再障后患丙肝(或戊肝)38例(戊肝27例)，其中男18例，女20例(戊肝男13例，女14例)。正常对照组为25名献血员，男15例，女10例，平均年龄24.1岁(19～30岁)。
先患肝炎后患再障，一般为再障发病前3个月以上患典型的肝炎症状，符合1990年全国病毒性肝炎学术会议修订的标准诊断。
二、试剂与仪器：
PCR扩增仪是美国PE公司生产的CT／I型。HCV－PCR试剂和酶标试剂均由黄道培先生(美国CLL公司)惠赠；HEV－PCR试剂盒由华美公司购入。
HCV－PCR引物
F1：5’－CGACACTCCACCATAGATCAC－3’。
R1：5’－ATGGAGCACGGTCTACGAGAG－3’。
F2：5’－TGTGAGGAACTACTGTCTTCA－3’。
R2：5’－CCTATCAGGCAGTACCACAAG－3’。
HEV－PCR引物
P1：5’－GCTATTATGGAGGAGTGTGG－3’。
R1：5’－CAGGGCCCCAATTCTTCTC－3’。
P2：5’－GCGTGGATCTTGCAGGCC－3’。
R2：5’－TTCAACTTCAAGCCACAGCC－3’。
三、样品处理：
取静脉血3 mL，2 mL加肝素抗凝，用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞，取1×105个细胞置于1.5 mL离心管内，加0.1 mL变性液，充分振荡摇匀，加0.1 mL的2mol/L乙酸钠(pH4.0)，1 mL饱和酚，摇匀，加0.2 mL氯仿／异戊醇(49∶1)，用力振荡10 s，置冰浴15 min，10 000 r／min 4℃离心20 min，取上层水相，加等体积异丙醇置－20℃1 h，使RNA完全沉淀，离心，用75%乙醇洗后干燥，溶解于TE缓冲液内，置－20℃保存备用。
余1 mL血自然凝固，取血清50 μL加裂解液100 μL于0.5 mL离心管内，混匀，置95℃15 min，10 000 r/min离心5 min，将沉淀溶于0.1 mL变性液(含4 mol/L 异硫氰酸胍，25 mol/L柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L β－巯基乙醇)备用。
四、RT／PCR扩增：
1.cDNA扩增：取0.5 mL的离心管，依次加入上述血清或单个核细胞提取备用液2 μL，10 U RNasin,10 pmol 引物，1 mmol dNTP,2.5 U 逆转录酶，反应缓冲液，总体积为20 μL。42℃保温60 min，混匀，95℃变性5 min，4℃3 min，加Taq酶0.5 U，做PCR扩增，94℃30 s55℃ 30 s72℃ 100 s，做35个循环。
2.PCR第二次扩增：取上述cDNA扩增产物10 μL于0.5 mL的离心管内，依次加入10 μL的10×PCR缓冲液，Taq酶2 U，dNTP 1 μL和5 pmol引物，反应体积30 μL，按94℃30 s55℃30 s72℃100 s(HEV－PCR按94℃45 s55 ℃ 45 s72 ℃ 60 s)进行35个循环，72 ℃延伸300 s。
3.电泳分析：取PCR扩增产物10 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳(内含溴乙锭0.5 mg/L)，在紫外灯下观察与阳性对照迁移距离一致的荧光带(310bp)者为阳性结果。
4.酶标定量分析：取PCR扩增产物20 μL，加酶联接头液，反应液，显色液，中止液，置室温暗盒内反应30 min，在自动酶标仪上测定，波长为A450nm读OD值，结果计算：
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