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红细胞带 蛋白C1肽链的纯化及其功能的初步研究 |
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然后以27 200×g，4℃离心30 min，上清用逆相高效液相色谱技术进行多肽检定，用气相氨基酸测序仪(Applied Biosystems, model 492)测序，回收C1肽链。
色谱分离的条件：采用逆相色谱柱Cosmosil C-18, 4.6 mm×250 mm，流动相为0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1% 三氟乙酸)。
新鲜红细胞膜血影的制备：全血40 mL，用PBS洗4次，然后溶解于5 mmol/L NaHCO3溶液中，用5 mmol/L NaHCO3洗2次，5 mmol/L NaHCO3含0.15 mol/L NaCl洗1次，调蛋白浓度至1 mg/mL。
温浴实验：取纯化的C1肽链，以0、5、10、30、80 μmol/L的浓度分别加入5个试管，冷冻离心干燥后向其中加入新鲜红细胞膜血影，轻轻混均，在37℃温浴1 h后在4℃以15 000×g离心20 min，上清用逆相高效液相色谱进行分析后，有多肽吸收峰的样品进行氨基酸测序。
SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)：蛋白分析采用laemmli 1970年报告的方法。蛋白质首先用Lowry法进行定量，然后用9%聚丙烯凝胶进行电泳分析。
结果
因为红细胞膜在自然状态下，带Ⅲ蛋白的C末端尾部对胰蛋白酶具有抵抗性。因此，我们选择不同浓度NaOH对细胞膜进行了处理，根据从红细胞膜释放C1肽链的多少最终确定100 mmol/L NaOH为最适浓度(图1)。C1肽链的释放以32 min多肽释放量为标准，后者在不同条件下释放量恒定，每一点为3次实验的平均值。图2显示了红细胞膜带Ⅲ蛋白在胰蛋白酶的作用下所释放多肽的HPLC图谱，多肽分析采用逆相色谱柱(Cosmosil C-18,4.6 mm×250 mm)和0～100%线性梯度的乙腈(内含0.1%三氟乙酸)，根据氨基酸测序确定了C1肽链的所在位置，收集C1肽链的样品，再以0.05 mL/min的缓慢流速进行2次HPLC分析，直至获得高纯度的C1多肽样品。
Fig 1 Effect of NaOH treatment on the amount of C1 peptide released into the supernatant
图1 氢氧化钠对红细胞膜C1肽链释放量的影响
Fig 2 HPLC analyses of membrane peptides released into the supernatant following trypsin treatment
图2 氢氧化钠预处理红细胞膜在胰蛋白酶作用下释放至上清中多肽的HPLC图谱
取C1多肽与新鲜红细胞血影进行温浴实验，经离心获得沉淀(红细胞膜)及上清(释放的多肽)，沉淀的SDS-PAGE图像显示当C1多肽在5、10 μmol/L时与对照实验(0 μmol/L)无差异，在沉淀及上清中均未见蛋白质带的增加或减少，但当C1多肽浓度达到30 μmol/L时，带Ⅲ蛋白及带4.1蛋白被逐渐分解(图3)，我们对温浴的上清进行HPLC分析，结果显示，当C1多肽浓度在5，10 μmol/L时，HPLC图谱为单一的主峰，经氨基酸测序证明该主峰为C1多肽和血型糖蛋白A(GPA)Lys101-Gln131，当C1多肽浓度升至30，80 μmol/L时，HPLC图谱显示了3个主峰，经氨基酸测序证明3个主峰分别为GPA Lys 101-Leu118\,GPA Ser119-Gln131和C1多肽，这说明当C1达到一定浓度后能激活一种特异性的酶，该酶切断了GPA Leu118-Ser119肽键，使单一的GPA Lys101-Gln131被切成两个肽链，而其它肽链没有激活此酶的作用(结果未发表)。
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