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红细胞带 蛋白C1肽链的纯化及其功能的初步研究 |
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傅国辉 姜晓姝 王孝铭 滨奇直孝*
摘 要 目的：研究红细胞带Ⅲ蛋白C1肽链(带Ⅲ蛋白Ala893-Va1911)的特性及其功能。方法：以100 mmol/L NaOH预处理红细胞膜血影，再用胰蛋白酶消化，采用高效液相色谱(HPLC)及氨基酸测序仪分析检定了从红细胞血影中释放的多肽，并纯化了带Ⅲ蛋白C1肽链，以不同浓度的C1肽链与新鲜的红细胞血影进行温浴。结果：C1肽链与红细胞内的新蛋白酶活性有关。
主题词 带3蛋白质；肽类；红细胞
Purification and characterization of C1 peptide released from band 3 protein
FU Guo-Hui, JIANG Xiao-Shu, WANG Xiao-Ming, Naotaka Hamasaki
Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin (150086)
Abstract AIM: In order to study the properties of C1 peptide(band 3 Ala893-Va1911).METHODS:The human erythrocyte white ghost were pre-treated by 100 mmol/L NaOH and then digested by trypsin. Using the HPLC and amino acid sequencer, we identified the peptides that released from white ghost, and purified the C1 peptides(band 3 Ala893-Va1911). The C1 peptides were used to incubate with fresh white ghosts.RESULTS:C1 peptides related with a novel protease activity.
MeSH Band 3 protein; Peptides; Erythrocytes
带Ⅲ蛋白(band 3)是由911个氨基酸组成，分子量约10万的糖蛋白质，它占红细胞膜蛋白质总量的25%［1］，其N-末端为亲水性，参与红细胞的各种生理活动［2］。C-末端为疏水性，预测它14次贯穿红细胞膜的脂质双分子层，这一区域也是C1-/HCO-3离子交换的活性部位［3］。位于红细胞内侧的、由32个氨基酸组成的C末端尾部与跨膜部分不同，其特点是含有大量携带负电荷、具有很强亲水性的氨基酸。这段肽链虽然有两个胰蛋白酶的切断位点，但在一般条件下，胰蛋白酶却不能发挥作用，说明C末端尾部并不像N末端那样游离于细胞浆内，可能与其它蛋白质发生相互作用或以其它形式附着在红细胞膜上［4］。本实验首先检定了在胰蛋白酶作用下从红细胞膜释放的多肽，并从中分离纯化了C1(Ala893-Va1911)肽链，再分别以不同浓度的C1肽链与新鲜红细胞膜血影进行温浴实验，对带Ⅲ蛋白C末端的特性及功能进行初步研究。
材料与方法
红细胞膜血影的制备：正常人血(4℃ 保存不超过2周)由日本国福冈市红十字中心血站提供，全血用PBS在室温条件下洗4次，然后悬浮于PBS溶液中，向该悬浮液中加入胰蛋白酶(0.2 mg/mL)在37℃条件下消化1 h，以去除红细胞膜表面的蛋白质。消化结束后再用PBS洗红细胞4次，向洗过的红细胞中加入20倍体积的5 mmol/L NaHCO3，使红细胞溶解，并在冰浴条件下搅拌5 min，同时加入蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟(0.2 mg/mL)，溶解后的红细胞在4℃条件下，以12 000×g，在4℃离心30 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，最终以1 mg/mL的蛋白浓度将红细胞血影悬浮在5 mmol/L NaHCO3溶液中［4］。
C1肽键的纯化：取分离制备的红细胞膜血影，向其中加入5倍体积的100 mmol/L NaOH，在冰浴中搅拌15 min，以28 400×g，在4℃离心20 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次后，重新悬浮于5 mmol/L NaHCO3溶液中，调蛋白浓度至1.5 mg/mL，向该样品中以15 μg/mL的浓度加入胰蛋白酶，在37℃条件下消化1 h，[1] [2] 下一页
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