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人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立 |
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d unknown genes. Up to now, 109 full length cDNA were successfully identified, including some novel immune molecules such as cytokines, cytokine receptors, chemokines and adherent molecules,the immune functions of which are under further investigation. Conclusion:The system for large scale sequencing of human DC cDNA library was successfully established and demonstrated as efficient approach to new molecule identification.
Key words Dendritic cells cDNA library Large scale sequencing Immune molecules Gene cloning
中国图书分类号 R392.2
人类基因组计划(Human Genomic Projects, HGP)是生命科学领域的一项跨世纪工程，目的在于获得人类的全部基因组信息，揭示人类生命的奥秘及疾病的发生发展规律，最终探索出战胜疾病的方法。随着分子生物学和计算机技术、生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱和发现新分子的有效手段［1，2］。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是一类重要的专职抗原提呈细胞(APC)，来源于髓系和淋巴系，可能存在不同的细胞亚群，不同来源及不同亚群的DC在机体免疫应答中可能发挥不同的作用。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已经成为免疫学的前沿领域和研究热点［3，4］。为深入认识DC的生物学功能，阐明其生物学作用的分子机理，我们在以往DC研究工作的基础之上［5-8］，建立了人DC cDNA基因文库的大规模随机测序体系，以期从DC中寻找和发现具有我国自己知识产权的免疫新分子。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 rhGM-CSF、rhIL-4和人淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)购自Sigma公司，FITC荧光标记的抗人HLA-A，B，C、HLA-DR、CD1a、CD40、CD14和B7-1单克隆抗体购自PharMingen公司，PE荧光标记的抗人CD83单抗购自Immunotech公司，cDNA质粒文库构建试剂盒购自Gibco公司，生物素亲和素磁珠mRNA纯化试剂盒(Boehringer), BigDye terminator四色荧光测序试剂盒购自Perkin-Elmer公司。
1.2 主要设备及软件 PCR9600、ABI377 DNA全自动测序仪及其数据采集软件Data Collection和分析软件Sequencing Analysis 3.0(Perkin-Elmer)、Sun-E450服务器及其操作系统Solaris2.6(Sun)，BLAST分析采用Wu-BLAST2.0软件(用Sun公司的Sunpro C语文编译)，所用核酸和蛋白数据库分别为EMBL(55.0，56.0，57.0)和Swissprot(36.0)，基因及蛋白分析软件为Wisconsin Package 10.0 (GCG)和Autostrider 1.2。
1.3 人树突状细胞(DC)的培养扩增 取正常成人外周血，经人淋巴细胞分离(Histopaque-1077)密度梯度离心分离单个核细胞，经无Ca2+、Mg2+的PBS洗两次后悬于RPMI1640完全培养基，置37℃、5%CO2培养2 h，弃上清，用预热的培养基洗去非贴壁细胞，然后加入含rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 500 U/ml、10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，收集培养第7天的悬浮细胞即为DC［8］，进行DC表型和功能鉴定，用于文库构建。
1.4 人DC细胞表型的FACS检测 5×105细胞悬于FACS标记液PBA(100 μl/管)中，加入100 μl荧光标记抗体(0.5 μg)，于4℃孵育30 min，PBA洗两遍后悬于PBA中，用流式细胞仪FACScalibar及其分析软件CELLQuest检测分析。
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