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跨膜突变型TNF |
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e enzymatically cleaved laying a foundation for the further study on the anti-tumor activity of TM-TNF.
Key words Transmembrane TNF-α(TM-TNF-α) Transmembrane TNF-α mutant (TM-TNFm-α) Site-directed mutagenesis by single-step PCR In vitro translation
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以17 kD分泌型（S-TNF-α）和26 kD跨膜型（TM-TNF-α）二种形式存在［1］。目前研究表明，TM-TNF主要是通过细胞-细胞间直接接触发挥局部生物学效应，其毒副作用较小，且可介导对S-TNF耐受细胞株的细胞毒作用［2,3］，这就为肿瘤的生物学治疗提供了新途径。但是TM-TNF-α是S-TNF-α的前体，易在某些蛋白酶的作用下转换为S-TNF［4］。为避免S-TNF的全身毒副作用,本研究用基因定点突变技术造成编码该酶切位点的核苷酸序列缺失，以获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm)。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、酶及主要试剂 质粒pbluescriptK(pBSK)和pGEM-3Zf及大肠杆菌E. coli TG1、JM109由本教研室收藏。AMV逆转录酶(美国GIBCO公司)；限制性内切酶(Hind Ⅲ, BamH I)、T4 DNA连接酶、体外转录翻译系统、非同位素体外翻译检测系统及犬胰腺微粒体(美国promega公司)；Tag DNA聚合酶(德国BNC公司)；m7 G(5′)ppp(5′)G(德国Boehringer Mannheim公司)。
1.2 重组pBK-TM-TNF的构建 按常规方法从人静脉血中分离单核细胞，LPS（100 ng/ml）刺激3 h后，提取细胞总RNA［5］。以此为模板，利用TM-TNF专一性引物(5′端引物为-GCGGATCCATGAGCACTGAAAG-
CATGATCC,3′端引物为CCCAAGCTTCAGGGCAATG-
ATCCCAAAGTA，德国Essen大学提供), 进行RT-PCR反应，反应总体积50 μl。反应条件为：94℃变性1 min，60℃退火1 min， 72℃延伸1 min，共30次循环；PCR产物纯化分离后，经BamH I/Hind III双酶切，与载体pBSK/BamH I+Hind III连接,并转化至大肠杆菌TG1中。得到重组质粒pBSK-TM-TNF-α。
1.3 一次重组PCR定位突变法（S-PCR method) 以重组质粒pBSK-TM-TNF为模板(0.1 μg)，在缺失部位两侧设计一对引物，5′端引物为GTAGCCCATGTTGTAGCAAAC，3′端引物为TGCCTGGGCCAGAGGGTT-
GAT(由本校分子生物学教研室合成)，PCR反应成分同上。PCR扩增条件为：94℃ 1 min，64℃ 2 min，72℃ 4 min，共35个循环。PCR产物纯化回收［6］后,用大片段Klenow酶室温处理1 h；酚/氯仿抽提后，用T4 DNA连接酶（20 U, 16℃孵育24 h）使线性DNA分子自身环化，再转化至大肠杆菌TG1，获得的克隆用TM-TNF特异性引物作PCR扩增，并与TM-TNF的PCR产物比较，初步筛选出突变重组体。
1.4 核苷酸序列的测定 采用PCR-双脱氧链终止法，在ABI 373a DNA测序仪上进行序列测定。
1.5 体外表达重组质粒的构建 将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf/Hind III，BamH I；转化大肠杆菌JM109，得到pGEM-3Zf-TM-TNFm重组质粒。
1.6 重组质粒的体外转录和翻译 按照体外转录系统试剂盒的实验指南进行操作，在T7 RNA聚合酶的作用下将质粒DNA体外转录成带帽mRNA。然后应用兔网织红细胞裂解物体外翻译试剂盒，以tRNAnscendTM tRNA为体外翻译合成特异性蛋白产物的标记物，在犬胰腺微粒体存在的条件下体外合成TM-TNFm。同时体外翻译合成TM-TNF未突变体作为对照。
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