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小鼠胸腺树突状细胞系的克隆化及基本鉴定 |
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的。体外建立胸腺基质细胞系并进行功能分析成为研究胸腺微环境作用的重要手段之一。我室由常规方法建立了14株小鼠胸腺基质细胞系［2］，细胞系的建立起源于多细胞培养，在成系过程中（一般须一年）虽有优势生长选择，而使成系的细胞群相当均一，但难免混有不同类型细胞，或同一类型细胞出现突变，可能显示不同特点。为精确了解单一亚群树突状细胞对T细胞发育的作用，我们克隆得到了多个胸腺树突状细胞株并进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 培养基及试剂 DMEM（GIBCO）＋10％NCS, 0.05％胰蛋白酶(DIFCO)＋0.02％EDTA(北京化工厂), PBS等。
1.2 抗体 大鼠抗小鼠角蛋白抗体， FITC标记的羊抗大鼠IgG（购自Sigma公司），大鼠抗小鼠树突状细胞抗体N418、抗MHC Class I及Class II抗体（由本室杂交瘤细胞分泌）。
1.3 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的建立 取4周龄正常Balb/c小鼠的胸腺，剪成糊状，贴壁细胞体外长期培养，建成小鼠胸腺基质细胞系，命名为MTSC4。
1.4 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的克隆化 对数生长期的MTSC4消化后，稀释成80个细胞／10 ml，以每孔100 μl加入96孔板中，37℃静置2 h后, 镜下观察并标记含单个细胞的孔。经3 w后，部分单个细胞已增殖为细胞岛，消化后扩增并冻存。各克隆细胞以2.5×104ml-1培养6 d，收集上清，-20℃冻存。
1.5 细胞表面标记的分析 将长有克隆细胞的盖片经冷丙酮固定后，分别滴加抗keratin、NLDC145 抗DC mAb、抗MHC Class I及抗MHC Class II等抗体，4℃过夜结合，PBS冲洗后，滴加FITC标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育30 min，充分清洗，荧光显微镜检查。
1.6 克隆细胞的倍增时间 将克隆细胞以5 000个细胞/孔加入24孔板，37℃培养，逐日用胰酶联合EDTA消化3孔细胞，显微镜下计数每孔平均细胞数，连续计数 8 d。
1.7 细胞因子检测 IL-6：96孔板每孔加入经不同比例稀释的rIL-6标准品及各克隆上清、DMEM(阴性对照)。IL-6依赖株7TD1经含2％NCS的PBS洗2遍后，37℃孵育30 min，配成5×104ml-1，每孔100 μl加在96孔板各孔中，37℃孵育68 h后，离心弃上清，加入1 mg/ml的MTT液50 μl/孔，37℃孵育4 h后，离心弃上清，加盐酸异丙醇120 μl/孔，ELISA-READER用双波长法（570 nm及630 nm）测OD值［3，4］。化学趋化因子：采用Boyden小室法［5］，下室加入各克隆上清及阳性对照肽(FMLP)或阴性对照液（DMEM），上室加入小鼠末梢血粒细胞悬液，中间隔以3 μm孔径的polycarbonate膜，37℃孵育，2 h后将膜取出，刮去膜上表面的细胞，经固定、染色后，高倍镜下计数膜下表面的粒细胞数，计算趋化指数(Chemotactic Index,CI)。
2 结果
2.1 MTSC4的克隆化细胞的获得 用有限稀释法克隆化MTSC4细胞，共获得14个细胞克隆，分别命名为MTSC4-1至MTSC4-14，克隆效率约为40％。这些克隆经半年的克隆化培养已能稳定生长，至今已连续培养1.5年。
2.2 MTSC4各克隆细胞表面标记的分析 结果见表1。在14个克隆中，各克隆均表达树突状细胞抗原而不表达角蛋白，表明为树突状细胞（DC）来源。各克隆均表达MHC Class II抗原而不表达MHC Class I抗原，也符合DC特点。但各克隆表达的DC抗原及MHC Class II 抗原强度有明显差异。
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