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人 型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达 |
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均参考文献［4］有关章节。
1.2.2 重组质粒的构建
1.2.2.1 重组中间质粒的构建 用限制性内切酶BglII消化质粒pCRTMII-TAgag1、pCRTMII-TAgag2,回收所需的编码部分gag基因的p55gag1(简称G1,nt546 bp～nt1 828 bp)和编码全部gag基因的p55gag2(简称G2,nt546 bp～nt2 114 bp,其中从nt1 828 bp～2 114 bp为gag、pol重叠区)基因序列。插入中间载体质粒pBluescript KS(简称KS)的BamHI位点中，使其符合正确的读码框架,筛选正向重组质粒。
1.2.2.2 重组表达质粒的构建 用限制性内切酶XbaI酶切正向重组中间质粒，经Klenow大片段补平，用限制性内切酶EcoRI消化回收后，定向插入到表达质粒pET-17b的EcoRI-EcoRV位点间。构建重组表达质粒。
1.2.3 IPTG诱导后融合蛋白的表达 将上述重组表达质粒分别转化受体菌E.Coli BL21(DE3)中，以只含质粒pET-17b的大肠杆菌为对照菌株作诱导表达。分别挑取转化菌落,接种到5 ml含200 μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中,37℃剧烈振荡培养至OD600=0.6～1.0,其中诱导表达组加入IPTG(400 mmol/L)至终浓度为1 mmol/L,37℃振摇培养3 h,对照组同样37℃振荡培养3 h,4℃5 000 r/min离心5 min收集菌体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.4 包含体纯化 诱导方法同上,5 000 r/min离心收集菌体,用1/10培养基体积的贮存液(50 mmol/L Tris.Cl pH8.0,2 mmol/L EDTA)重悬,加入溶菌酶至终浓度100 μg/ml,再加1/10体积1%的TritonX-100,30℃温育15 min,置冰浴中超声波处理,或加DNA酶至终浓度20 μg/ml,室温10 min放置使其不再粘稠,12 000 r/min离心15 min,上清液中含有可溶性蛋白,加入等体积2×SDS上样缓冲液,沉淀为不溶性部分(包含体部分),重悬于1×SDS加样缓冲液中,室温下电泳。
1.2.5 重组质粒表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 参照文献［4］方法，以含质粒pET-17b的细菌和标准蛋白分子量作对照，进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后观察。
1.2.6 表达产物的Western blot检测 经1.2.5分离的蛋白,转移到硝酸纤维素膜上封闭1 h,以HIV-2病人全血清作为第一抗体,以碱性磷酸酶标记的抗人IgG为第二抗体,分别在室温感作2 h,用BCIP/NBT进行显色。
1.2.7 目的蛋白表达量的测定 分别取40 μl溶菌悬液和沉淀加样溶液作SDS-PAGE，经考马斯亮蓝R250染色、脱色干燥后，用CS-9000型薄层扫描仪测定其560 nm波长下的吸收值，测定目的蛋白的相对含量。
2 结果
2.1 中间质粒、重组质粒的构建(图1)，中间质粒命名为pKSG1和pKSG2，重组质粒分别命名为pG1和pG2。
图1 重组质粒的构建示意图
Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmids
2.2 SDS-PAGE分析及Western blot 表明含pET-17b的对照菌体,在51和61 kD处均未见明显蛋白带,表达pG1、pG2的菌体相应位置各多出一条蛋白条带如图2。将含表达质粒pG1的 E.coli BL21(DE3)诱导菌体表达产物转移至硝酸纤维素膜后，经HIV-2病人全血清检测表明,在51 kD处显现特异性反应显色带，对照菌体未见反应显色带。同样，pG2经Western blot检测后，在表达受体菌体61 kD处也出现特异性反应显色带，其分子量与预计相符。但在比61 kD小的50～60 kD处亦有一条较弱的特异性显色带,与pG1表达的蛋白大小相符。pG1和pG2经与健康全血清反应后均未见特异显色带，制备pG1和pG2的包含体后, 进行了Western blot仍然得到同样结果。
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