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非小细胞肺癌中p16 INK4 CDKN2基因的缺失和点突变 |
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>1 材料与方法
1.1 标本 经病理确诊的31例人原发性非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)
及其癌旁正常组织手术标本取自本校肿瘤医院和附一院，其中20例存在淋巴转移。3
例正常人肺组织取自意外事故者。
1.2 DNA模板制备及PCR扩增 常规方法［3］提取组织DNA。PCR扩增条件：1×PCR缓冲
液，4×dNTP各200μmol／L，一对p16基因预扩增区域引物(表1)各20 pmol，DMSO 1μl，
样品组织DNA0.1μg，补dH2O至24μl。混匀，液体石蜡覆盖，97℃预变性5分钟，85℃
加入Taq DNA多聚酶2U，接着94℃ 30秒，53～55℃(表1)50秒，72℃ 50秒，循环35次，
最后72℃保温7分钟。
1.3 PCR-SSCP银染分析［3］ 取PCR产物5～10μl，加入甲酰胺变性液10μl，加热变
性后骤冷，上样8%PAG，120V电泳12～16小时，凝胶银染后拍照。
1.4 序列分析 以低熔点胶法［4］纯化的PCR产物1.5μg为模板，单侧PCR扩增引物为
测序引物，使用测序酶试剂盒(sequenase version 2)［5］进行双脱氧末端终止法测
序反应。
1.5 双重PCR扩增 在上述p16基因PCR扩增体系中，再加入扩增GAPDH基因引物(表1)
各20pmol，Taq DNA多聚酶3U，其它条件与以上PCR扩增一致。
2 结果
2.1 PCR方法建立 以正常人肺组织DNA为模板，一组以4对引物分别PCR扩增p16基因
的3个外显子，另一组则再加入GAPDH基因扩增引物进行双重PCR扩增。产物经1.2%琼脂
糖凝胶电泳，结果显示每对引物的扩增产物大小与设计一致。
2.2 p16基因缺失检测 以正常人肺组织及肿瘤癌旁正常组织DNA为正常对照，GAPDH基
因为内对照，对31例人原发性NSCLC组织中p16基因的3个外显子分别进行了PCR扩增，
分析p16基因缺失情况。3例样品显示可能存在p16基因缺失(图1，表2)：1例(例23)p16
基因的3个外显子均无扩增产物，另2例则分别在p16基因外显子1(例7)和外显子2(例21)
区域无扩增产物。
表1 p16及GAPDH基因PCR扩增引物
Tab 1 PCR primers of p16 gene and GAPDH gene
Amplified fragment
(扩增片段) (片段长度bp) Primers
(引物序列) Annealing temp.(℃)
(退火温度℃)
p16 E1
(5′UTR-intron1) 280 p1F 5′-TCTGCGGAGGGGGAGAGCAG-3′
p1R 5′-CGCTACCTGATTCCAATTC-3′ 55
p16 E2A-2C
(intron1-codon102) 244 p2AF ′-ACAAGCTTCCTTTCCGTCATGCCG-3′
p2CR 5′-CCAGGCATCGCGCACGTCCA-3′ 55
p16 E2B-2D
(codon 82-intron2) 242 p2BF 5′-TTCCTGGACACGCTGGTGGT-3′
p2DR 5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′ 55
p16 E3
(intron 2-3′UTR) 189 p3F 5′-GGATGTTCCACATCTTTG-3′
p3R 5′-ATGAAAACTACGAAAGCGGG 53
GAPDH
(codon 4-359) 356 pGF 5′-GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′
pGR 5′-GAGATGATGACCCTTTTGGC-3&上一页 [1] [2] [3] 下一页
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