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用RT |
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1基因是不表达的。提示
我们可以检测个体的FMR-1基因表达来诊断脆性X综合征A患者。我们采用RT-PCR技术对2
个经细胞遗传学方法筛查出的脆性X家系进行了分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 患者和家系的细胞学检查 对可疑为脆性X综合征家系的成员，按常规方法进行细胞
遗传学检查。发现两个家系中均有脆性X患者，两患者均有典型的临床症状。对其家系
成员提取RNA并进行RT-PCR。
1.2 外周血细胞质总RNA提取 外周血400μl，肝素抗凝，按Nicholas方法［4］提取RNA。
1.3.1 引物设计 根据Verkerk等［1］报道的FMR-1基因cDNA序列，并参照Pai等的报道［5］，
设计合成了两对引物，其序列和相应于cDNA位置如下：引物1F(5′端引物)：838－862 5′
-CTTGCCTCGAGATTTC-ATGAACAG-3′；引物1R (3′端引物)：1018－1044 5′
-TCAGCAAATTCGAGAAAGCT-TC-3′；引物2F(5′端引物)：881－899 5′
-CATGGGTACTAGCTA-TTGG-3′；引物2R(3′端引物)：999-1018 5′-CTTTTTTCACTGCATCCTG-3′。
根据Gibbs等［6］的报道合成了对引物作为内对照，用来检测位于X染色体上的HPRT基因的
转录产物，命名为47F(5′端)和48R(3′端)，这对引物通过RT-PCR可扩增出387bp的cDNA片段。
1.3.2 反转录 10μlRNA 样品加引物1R(1μl，25pmol／μl)加引物48R(1μl，25pmol／μl)
65℃水浴10分钟，置冰上，降至室温，加逆转录缓冲液(5×)4μl，dNTPs，RNase inhibitor，
加AMV 5 U。混匀，42℃水浴1小时，置－20℃保存。
1.3.3 PCR扩增 套式PCR：第1轮使用引物1F和引物1R，引物47F。第2轮使用引物2F和引
物2R，引物47F和引物48R。反应条件：94℃变性10分钟，然后94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，
72℃ 1分30。循环35次(PE 480)，最后一次循环在72℃延伸10分钟。
2 结果
2.1 细胞遗传学检测结果 两个家系中的男性患者的脆性X染色体检出率分别为25%和32%。
2.2 RT-PCR扩增结果 把两家系的患者及其父母的RNA提取出来，进行RT-PCR。需要指
出的是引物
图1 脆性X家系的RT-PCR扩增结果 M为PBR322DNA-Bst NⅠ digest.1，2分别PCR空白对
照，3-5分别为父、子(患者)、母
Fig 1 Agarose Gel(2%) separation of RT-PCR products,M is PBR 322 DNA-Bst N I digest.Lanes1
and 2 are negativecontrols without DNA PCR correspondingly.Lanes 3-5 are father,son (patient) and
mother respectively
图2 脆性X家系的RT-PCR扩增结果 M为PBR322 DNA-Bst N I digest.1，2为PCR空白对
照，3-5分别为子(患者)、父、母
Fig 2 Agarose gel(2%) separation of RT-PCR products.M is PBR 322 DNA-Bst N I digest.Lanes1
and 2 are negativecontrols without DNA PCR correspondingly.Lanes 3-5 are son(patient),father and
mother respectively
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