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用SSLP连锁分析进行成人多囊肾病快速基因诊断的研究 |
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y words】 Adult polycystic kidney disease Genetic diagnosi
Simple repeated sequence Simple sequence length polymorphism
成人多囊肾病(adult polycystic kidney disease, APKD)，是最常见的单基因遗传病之一，
发病率为1／1000［1］。患者常于40～60岁死于晚期肾功能衰竭所致的尿毒症，目前临床
缺乏有效的治疗方法。值得注意的是，由于该病为迟发显性，患者40岁左右才发病，这
时很可能已将致病基因传给了后代。
近年来APKD的基因诊断有了很大的发展［2～4］。简单序列长度多态性(simple
sequencelength polymorphism, SSLP)的显示依靠PCR法，快速、简便、安全。如用SSLP
连锁分析法进行APKD的基因诊断，则较之传统的Southern法更具实用和推广价值。
我们应用PCR法扩增PKD1近端一个微卫星序列SM7，观察SM7在中国人群中的多态性，
并以SM7为标记对两个APKD家系进行SSLP连锁分析，同时和3′HVR／Pvu ⅡSouthern杂交
结果相对照，初步评价SM7在APKD基因诊断中的价值。
1 材料和方法
1.1 正常人和APKD家系情况 67名无血缘关系的正常人标本来自中山医科大学医学遗传
学教研室临床室G6PD、地中海贫血筛查正常个体。APKD家系1中(图1)，先证者Ⅰ1(58岁)
为成人多囊肾病、尿毒症患者，Ⅱ1(35岁)亦为患者，2人B超检查均为阳性；
图1 家系1系谱图
Fig 1 The pedigree of family 1
图2 家系2系谱图
Fig 2 The pedigree of family 2
Ⅱ(34岁)、Ⅱ4(31岁)无症状，B超阴性；Ⅲ1(9岁)未行B超检查。家系2中(图2)，先证者
Ⅰ1(已故)为成人多囊肾病、尿毒症患者，Ⅱ1(34岁)、Ⅱ2(30岁)、Ⅱ5(24岁)均为患者，
B超阳性，Ⅱ6(22岁)正常，B超阴性，Ⅱ4(27岁)、Ⅲ1(2岁)无症状，未行B超检查。
1.2 探针制备 含有3′HVR重组质粒(pSP64)的菌种由荷兰惠灵顿大学Breuning MH博士惠
赠。提取质粒后，分别用EcoRⅠ、HindⅢ酶切，电泳洗脱法回收插入的4.0kb片段。
1.3 探针α-32P-dCTP标记按缺口平移试剂盒(BRL)操作。
1.4 样本DNA制备及印迹杂交 抽取受检者外周血3～8ml，常规酚、蛋白酶K法抽提白细胞
DNA。8μg样本DNA以限制性内切酶PvuⅡ消化，0.8%琼脂糖电泳分离，Southern法DNA转移，
42℃预杂交、杂交，洗膜，－70℃放射自显影7～10天。
1.5 PCR扩增 SM7引物序列［5］：5′-ACATATGTAGTCTTCTGCAGG-3′；5′-ACAAGAGTGAATC
TCTGACAG-3′；反应总体积30μl。反应条件：97℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃45秒，
72℃45秒，35个循环，末次延伸72℃ 5分钟。
1.6 甲丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色 取10μl PCR产物于10%普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，
电泳完毕后将凝胶以硝酸银-甲醛显色，干燥保存。
2 结果
附表 各等位片段频率分布
Tab Details of SM7 alleles
Allele length(bp)
(等位片段长度) Allele frequency
(等位片段频率)
Y5 99 0.029
Y6 97 0.059
Y7 95 0.104
Y8 93 0.059
Y9 91 0.582
Y10 89 0.134
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