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中国人群DXS102座位多态性鉴定及其应用 |
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一些学
者认为，很多种在白种人中普遍存在的RFLP酶切多态性在中国人中不存在［2］。所以在
中国人群中应用RFLP连锁分析进行基因诊断有很大的局限性。人类基因组中存在的短串
联重复序列(short tandem repeats, STR)具有高度多态性，已越来越多地被用于基因诊
断的研究，但迄今为止国内外尚未见用STR多态进行血友病B基因诊断的报道。
我们尝试将DXS102 STR多态座位用于血友病B基因诊断。DXS102座位为二核苷酸STR
标志(AC)n，已通过26个CEPH家系分析证明符合孟德尔共显性遗传规律［3］。DXS102和
hFⅨ之间紧密连锁(Lods＝13.6，＝0.002)［4］。我们应用PCR扩增片段长度多态性
(Amp-FLP)，鉴定了中国人群DXS102座位的多态性，并对血友病B家系进行连锁分析及携
带者筛查，旨在提供一种新的有效的血友病B基因诊断方法。
1 材料和方法
1.1 DNA样品 正常人234条无亲缘关系的X染色体，其中女性154条，男性80条。1个血友
病B家系采自浙江温州，其中一名血友病B患者于1994年接受本实验室开展的基因治疗。
DNA提取采用抗凝血经淋巴细胞分离液分离白细胞，常规酚氯仿法提取。DNA浓度用紫外
分光光度计测定。
1.2 引物 DXS102-1∶5′-GTAGTCTCAGTCGA-CATGCTTTGAC-3′；DXS102-2∶5′-GCTGAGAA
-AGTAGATCCTAAGTGTTC-3′(中国科学院上海细胞所合成)。
1.3 PCR扩增 PCR反应总体积50μl，含25ng样本DNA，两个引物各15ρmol，2mmol／L
dNTP,1×Taq DNA聚合酶缓冲液(50mmol／L KCl，10mmol／L Tris-HCl，pH8.0，15mmol／L
MgCl2，1% Triton X-100)和1U Taq DNA聚合酶。反应条件为：前面10个循环为94℃变
性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸30秒，后面25个循环将退火温度降到63℃。最后一
步反应为72℃延伸10分钟。
1.4 DXS102PCR扩增产物的电泳和银染 将PCR产物4μl，加2μl 2∶1加样缓冲液，在
变性聚丙烯酰胺凝胶上〔含7mol／L尿素，6%丙烯酰胺／甲叉物(19∶1)〕，以恒功率
50W，50～55℃电泳4小时，然后用银染的方法进行显色(银染过程按照Promega的Silver
Sequence DNA Sequencing System)。
1.5 DXS102 PCR产物的多态性分析及数据处理 二核苷酸STR在银染后的凝胶上特征为
呈一条浓密的主带和由于PCR滑移造成的数条各间隔2bp逐渐浅淡之影子带。等位片段
按浓密主带所在位置确认。从凝胶上直接判读每个个体基因型，计算各等位片段频率，
其标准误按［f(1-f)／2N］1／2(n－1)计算。f为等位片段频率，n为样本个体数［5］。
杂合度观察值由样本基因型直接算出，无偏估测值(unbiased estimate)按
n［1-∑(ni／n)2］／(n-1)算出，n为样本等位片段总数，ni为各等位片段数。多态信
息含量(polymorphism informationcontent,PIC)按1-∑f2i统计，f为等位片段频率。
1.6 各等位片段PCR产物克隆测序 分别将各等位片段PCR产物克隆到pGEM-T载体上(购自
Promega公司)，用α32-PATP进行标记，双脱氧法测序，测序结果用放射自显影显示。T7
测序盒购自Pharmacia公司。
2 结果
2.1 中国人群DXS102座位的多态性及与欧洲人群中多态性的比较 我们用Amp-FLP扩增
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