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中国人细胞色素P4502D6基因多态性 |
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多态性进行了研究。
1 材料和方法
1.1 样本的选择 100名健康汉族人，来自门诊健康查体和本校94年级研究生。排除锥
体外系、类风湿等疾病。其中男性58名，女性42名，年龄28～70岁。
1.2 DNA的提取 抽静脉血10ml，肝素抗凝，利用常规酚／氯仿抽提法提取DNA，采取紫
外分光光度法根据OD260值将DNA稀释至0.5μg／ml。
1.3 CYP2D6基因引物的设计与合成 参照文献［5，6］以CYP2D6基因的保守区作为引物序
列，引物的序列(引物由美国帕金森氏病研究所合成)及其在该基因上的位置详见表1。
1.4 PCR-RFLP分析 PCR扩增是用Perkin-Elemer9600热循环仪，反应总体积50μl，含
有200μ mol／L dNTP、0.25μ mol／L的引物、5%的DMSO、0.4μg DNA、1UTaq DNA聚
合酶(华美生物工程公司)、10mmol Tris-HCl(pH9.0)、1.5mmol MgCl2、50mmol KCl、
0.1%Triton X-100。
表1 引物的序列及在CYP2D6基因上的位置
Tab 1 Sequence of PCR primers and their positions on the CYP2D6 gene
Primer
(引物) Sequence(序列) Position(位置)
P1 5′-TGCCGCCTTCGCCAACCACT-3′ 1927-1846
P2 5′-GGCTGGGTCCCAGGTCATAC-3′ 2638-2657
P3 5′-GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3′ 2618-2638
P4 5′-CCGAGAGCATACTCGGGAC-3′ 2868-2886
用引物P1和P2扩增第3～4号外显子，循环条件为95℃ 30秒，61℃ 30秒，72℃ 90
秒，35个循环。将扩增产物20μl用BstN Ⅰ限制性内切酶(New England Biolabs产品)
消化2小时后，10%的聚丙烯酰胺电泳。若存在29B突变时，原来存在于内含子3与外显子
4之间的BstNI酶切位点丢失。
参照文献［6］用引物P3和P4按94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，35个循环扩增，
扩增产物用HpaⅡ限制性内切酶(Promega产品)消化2小时后，10%的聚丙烯酰胺电泳，确
定29A突变。
1.5 XbaⅠ限制性片段长度多态分析 10μg基因组DNA用50UXbaⅠ限制性内切酶(宝灵曼
产品)消化过夜后，在0.5%的琼脂糖凝胶上电压为0.5V／cm电泳48小时，然后转移至尼
龙膜上，用地高辛DNA标记检测试剂(宝灵曼产品)标记的CYP2D6 cDNA探针(CYP2D6 cDNA
由美国帕金森研究所提供)杂交。可见到44kb、29kb、13kb和11.5kb片段。
2 结果
2.1 100名中国人CYP2D6基因多态性分布频率特点见表2及图1。
表2 100名正常人CYP2D6基因多态性分布
Tab 2 Distribution of CYP2D6 gene polymorphism in 100 normal Chinese
Allele(等位基因) n(等位基因数) frequency(频率)
A 2 0.010
B 13 0.065
D 1 0.005
E 2 0.010
Total(合计) 18 0.090
图1 CYP2D6 基因外显子3～4扩增产物的BstNI酶切分析
Fig 1 CYP2D6 gene exon 3 to exon 4 PCR products digested with Bst NI Lanes 1,4：homozygouswild type; Lane:
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