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三核苷酸重复序列PCR扩增中影子带的产生及其消除的方法 |
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Taq＋Pwo DNA
polymerase. Conclusion The results of this experiment demonstrate that shadow bands occur during
the PCR. Pwo DNA polymerase in known to possess not only DNA polymerase activity, but also
3′-5′ exonuclease activity, or proofreadingability. The mixture of Taq DNA polymerase and
Pwo DNA polymerase has higher processivity thanTaq DNA polymerase itself. This may explain
the effect on eliminating or reducing the occurrence of shadow bands in polymerase chain reaction.
【Key words】 Polymerase chain reaction Shadow bands Trinucleotide repeats
DNA重复序列的检测在人类DNA多态研究和连锁分析中占有重要的位置。诸如三核
苷酸重复等大量微卫星DNA即可作为遗传标记使用，某些短重复序列的异常在遗传疾病
和肿瘤发生中还具有病因学意义。因此短重复序列的PCR扩增和检测已成为许多实验室
的日常工作。然而，在重复序列的PCR扩增产物的电泳检测时，除主带外常可见一些显
色较浅的影子带［1］，后者常使等位片段的判读产生困难，从而影响对结果的正确分
析和临床诊断。如何消除这些影子带一直是许多研究者关注的问题，而迄今尚未见较
系统的研究和如何避免影子带产生的报道。有鉴于此，我们以人类强直性肌营养不良
致病基因-肌张力蛋白激酶基因(myotonin protein kinase gene,MT-PK)3′端非翻译
区中的CTG重复序列为材料，重点考查了PCR扩增时不同聚合酶或酶的组合对影子带产
生的影响，并根据实验的结果就影子带产生的机理进行了讨论。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 62例标本为本室采集的非相关正常人标本，年龄20～54岁。图1标本系其中的4
个样品，且每组比较的结果均分别来自对同一个体的同批DNA标本PCR扩增的结果。
1.1.2 寡核苷酸引物 参照Mahadevan等［2］合成。其序列为：正向引物：
5′-GCTCGAAGGGTCCTTGTAGCC-3′；反向引物：5′-GGGGGTGCGTGGAGGATGGAA-3′。引物
分别位于19q13.3上的MT-PK基因3′非编码区中的CTG重复序列两侧，该重复区在正常群
体中呈高度多态［2～4］。
1.1.3 外周血DNA按常规方法制备［5］。
1.1.4 耐热DNA聚合酶 Taq和Pwo DNA聚合酶分别购自BRL和Boehringer Mannhein公司。
1.2 实验方法
1.2.1 PCR扩增 PCR扩增按常规方法。在PE-9600型扩增仪上进行。反应体积为50μl，
内含10mmol／L Tris-Cl(pH8.8)，25mmol／L KCl，5mmol／L(NH4)2SO4，1.5mmol／L
MgCl2，200μmol／L dNTP，300nmol／L引物，50ng模板DNA，Taq DNA聚合酶或Taq＋Pwo
混合酶(5∶1) 1.5U。在95℃预变性8分钟，进入循环。循环条件为：94℃ 30秒，60℃ 30秒，
72℃ 20秒，共30个周期。最后在72℃延伸7分钟。每批反应均设置阴性对照，即反应
系统中以等体积灭菌超纯水代替模板DNA。
1.2.2 PCR产物的电泳检测 电泳用BRL公司的丙烯酰胺凝胶按丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺
19∶1的比例制成8%的非变性胶板，PCR产物中加入1／6体积的上样缓冲上一页 [1] [2] [3] 下一页
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