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用PCR快速筛选递次截短的DNA克隆 |
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fragments in other plasmid vectors.
【Key words】 Ploymerase chain reaction Rapid selection Analysis of gradually shortened
DNA
DNA递次截短分析作为一种直接而有效的手段［1］，常用于大片段DNA测序、DNA结
合蛋白的识别位点和作用位点的确定、蛋白质功能区的划分等研究。通常，在同一个核
酸酶酶切反应体系中，于某一反应时间点取出的DNA样品尽管琼脂糖凝胶电泳检测仅显
示一条带，但实际上仍含有大小不同的片段，因此必需作进一步的鉴定。常规的鉴定方
法是用限制性内切酶切割使质粒线性化，并通过电泳比较分子量而筛选出一系列插入片
段递次截短的缺失克隆。但由于载体的存在，导致分子量增大，在电泳检测时难以准确
鉴定插入片段长度较为接近的克隆。为此，我们建立了以PCR为介导的鉴定方法，按载
体多克隆位点两侧的序列设计引物，直接以菌落进行PCR扩增，产物即为插入的已截短
的目的片段。这种方法不仅能提高鉴定截短后片段长度的准确性，而且快速、简便、经
济。
1 材料与方法
1.1 缺失克隆的制备 重组质粒pFD27由1.5kb cDNA与载体pGEMT(Promega公司)构建而
成。为测定cDNA全序列，制备一组递次截短约150bp的亚克隆。参照Biotech的Double
-stranded Nested Deletion Kit的操作步骤，分别在外切酶作用的第3、6、9、13、
17、21、26、31、36分钟时取样，编为1～9号，重新环化后转化宿主菌E.coli JM103。
1.2 缺失克隆的快速鉴定 (1)PCR引物设计：按载体pGEM-T多克隆位点的两侧序列设计
引物(它可作为pGEM-T和pUC系列载体的通用引物)：正向引物(F)：
5′ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′；反向引物(R)：5′TCACACAGGAAACAGCTATGAC 3′；
(2)PCR模板的制备［2］：在1～9号缺失子转化平板上，分别用灭菌牙签挑取3个已作了
编号的菌落，置于20μl DNA抽提液中，煮沸5分钟，冰上骤冷，12000r／min离心5分钟，
吸取上清作为PCR扩增模板；(3)PCR扩增：反应体系中Taq DNA聚合酶1U，正／反向引
物(25μmol/L)各0.5μl，5mmol/L dNTP 1μl，10×反应缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCl2
0.75μl，模板1μl，加水补充至25μl，上覆20μl石蜡油，反应条件：93℃预变性3分
钟，93℃ 1分钟，64℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，35个循环后，72℃延伸5分钟；(4)电泳
检测：将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，以长度递次相差150bp左右为标准选出缺失亚
克隆。1.3 缺失克隆的限制酶切对比 接种选出的克隆(编号a～i)，提取质粒，各取200ng，
在15μl体系中以ApaⅠ酶切，37℃ 2小时，电泳检测。
1.4 测序 参照Promega公司PCR循环测序试剂盒说明书进行。
2 结果与讨论
2.1 提高对插入片段长度差别的分辨率 在每个取样时间随机取3个缺失克隆，计27个
克隆；另加空白对照和未经核酸外切酶处理的克隆各一个，共计29份样品。用PCR扩增
插入片段后，以递次相差150bp左右为标准，从中选出9个亚克隆，按插入片段的长短
依次命名为克隆a～i。从附表可以看出，这九个亚克隆分别是从5个取样时间得到的，
表明同一取样时间的缺失亚克隆的插入片段长度不均匀。例如经外切酶处理3分钟不
仅有较长插入片段的克隆a，也存在较短插入片段的克隆e。当用菌落直接PCR扩增插
入片段时，就可获得如图1A所示的电泳结果，相差150bp的插入片段明显地呈梯形图
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