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用银染法测定人睫状神经营养因子基因的核苷酸序列 |
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ega公司的WizardTMminipreps DNA 纯化药盒。步骤如下：离心
(12 000r／min 30秒)收集1.5ml过夜培养物的细菌沉淀，悬浮于200μl细胞悬浮缓
冲液中，再加200μl裂解液，混合至溶液清亮，然后加200μl中和液，11 500r／min
离心5分钟，上清与1ml WizardTM minipreps树脂混匀后，加于小柱上，用2ml洗柱液
11 500r／min离心2分钟洗柱，最后用50μl预热的TE缓冲液离心(11 500r／min,20秒)
洗脱DNA。洗脱液加5μl 3mol/L NaAc，2.5体积无水乙醇，－20℃放30分钟后，
12 000r／min离心5分钟，沉淀用70%乙醇洗涤后空干，溶于100μl ddH2O中。
1.2 测序反应 在0.5ml离心管中，加入质粒DNA模板5μl(约2μg)，5μl DNA测序缓冲
液(5×：250mmol/L Tris-HCl pH9.0;10mmol/L MgCl2)和6pmol PUC／M13测序引物(正
向，24聚体)，加ddH2O至16μl，后加1μl测序级Taq DNA聚合酶(5U／μl,promega)混
匀后，将上述酶／模板／引物混合物以每管4μl分别加入含2μl各d/ddNTP的PCR反应管
中(分别含45μmol/L ddGTP 或525μmol/L ddATP 或900μmol/L ddCTP或300μmol/L
ddCTP，及7-脱氮-dGTP和d(A.T.C)TP各30μmol/L。94℃ 5分钟后，以94℃变性30秒和
70℃退火／延伸1分钟进行60个测序反应循环。反应完毕后各加3μl测序终止液(10mmol/L
NaOH，95%甲酰胺，0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝)，混匀，终止测序反应。
1.3 测序胶电泳 测序反应产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(其中含7mol/L尿素，
丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺=19／1)分离。为便于电泳后的染色操作，将制胶用的两
块玻璃板中的一块硅化，另一块用Bind-Silane(Pharmacia公司)处理，灌制0.4mm厚
的薄层胶，电泳缓冲液为1×TBE，测序反应产物在90℃水浴上加热2～3分钟后，取约
3μl上样于鲨鱼齿梳形成的样品孔中，40W恒功率电泳。
1.4 银染和APC胶片自显影 电泳结束后，小心将两块玻璃板分开，凝胶应完好地粘
附在用Bind-silane处理过的玻璃板上。用10%冰醋酸固定20分钟以上。ddH2O洗3次，
每次2分钟，然后在0.1%AgNO3-0.056%甲醛溶液中孵育30分钟，短暂水洗后，置含
3%Na2CO3，0.056%甲醛和2mg/L硫代硫酸钠的显色液中显色。当测序条带可见时，
用10%醋酸终止显色反应，再用ddH2O洗两次(各2分钟)。然后于X光观片灯下观察
测序结果。如需长久保存测序结果，可用Kodak电泳复制胶片(APC胶片)进行数秒
钟曝光，然后同X光片一样冲洗。
2 结果
用上述银染法测定了hCNTF基因全序列，结果
附图 hCNTF基因的银染测序凝胶自显影图谱(部分)
Fig Autograph of silver stained sequencing gel of hCNTF gene(part)
与文献报道完全符合，附图给出了部分银染测序胶的自显影图谱，从中可读出约300个
以上碱基的序列。
3 讨论
我们介绍的银染测序方法是一种十分迅速而又经济简便的测序方法，与同位素测序
相比，除了无放射性污染外，整个过程所需时间也大大缩短，电泳完毕后只需90分钟染
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