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大鼠小肠肌间神经丛中NOS神经元的发育研究 |
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肖 岚 蔡文琴
(第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038)
摘 要 为研究大鼠小肠肌间神经丛NOS神经元的发育，用NADPH-黄递酶组织化学法及图像分析对胚胎至老年各时期小肠肌间神经丛的NOS神经元发生进行观察。结果显示：NOS神经元于E13d出现，但极稀少，之后逐渐增多，其密度(细胞数／面积)至出生后1周达到高峰，以后逐渐下降，至成年到最低值，直至老年无明显改变；NOS神经元胞体大小逐渐增加，至成年时最大，约为出生时的2倍，直至老年无明显改变；NOS神经元分布，胚胎初为无规律散在排列，大约在出生后1周聚集成明显的神经节。本研究揭示了小肠肌间神经丛NOS神经元的发育变化规律。
关键词 一氧化氮合酶(NOS) NADPH-黄递酶 肌间神经丛 发育 大鼠
一氧化氮(NO)是近年来发现的一种特殊的信使分子，在神经系统中充当神经递质或调质，其内源合成由专一的一氧化氮合酶(NOS)催化L-ARG生成，NOS广泛分布于多种组织，神经组织中的NOS已被证明就是NADPH-黄递酶(NDP)，因此，NDP被作为神经元NOS的组织化学标志物而应用于NOS的定位研究［1］。研究表明，小肠肌间神经丛中有较多的NOS神经元分布［2］。其作用主要是释放NO后，通过使胃肠平滑肌细胞中cGMP升高而使平滑肌舒张。由于胃肠道NOS神经元的缺如或发育不良所致的NO缺乏常与胃肠肌肉运动失驰缓疾病如进行性胃扩张、婴儿幽门狭窄、先天性巨结肠等有关［3］。因此，研究肠道NOS神经元的发育，不仅能为发育神经生物学提供基础资料，而且对临床的某些疾病的发病机制及病理生理学提供依据。这方面研究国外报道极少，国内尚未见同类报道。为此，本研究的目的主要是对胚胎至老年大鼠小肠(空肠)肌间神经丛中 NOS神经元的发育及其与年龄相关的变化进行观察，并通过图像分析处理，以探求小肠壁内NOS神经元的发育规律。
材料和方法
1.动物分组
Wistar大鼠52只(雌雄不拘)，以胚胎期及出生后两阶段进行分组，胚胎期按胎龄(阴栓龄)分4组：E13、E16、E18、E19 d，每组5例；出生后分新生期：0～2d、1周、2周各5例；幼年期(1月)5例；成年期(4～8月)8例；老年期(24～26月)4例。
2.取材及标本制作
将胚鼠取出放入4%多聚甲醛，0.1mol/L PB液(pH7.3)中稍许固定后用钟表镊轻轻剥离出小肠前段放入上述固定液中，于4℃固定2h后移入0.05mol/L的TBS(pH7.4)中，于4℃再放置3～5h，切取部分作恒冷箱冰冻切片(横切面，厚20μm)，贴片，其余留作整封染色。新生组大鼠取空肠约2cm，用一适当口径的玻棒伸入腔中使肠壁扩张，作成整封肠管后入4%多聚甲醛中固定2h，再移入TBS，于4℃放置3～5h至染色。其余大鼠则取空肠约3～5cm经4%多聚甲醛固定2h后分离纵肌层行肠肌层铺片，将所得撕片置入TBS中2～4h至染色。
3.DNP组织化学染色
参照伦敦大学Burnstock实验室的方法配制作用液：0.2g/L NBT，2.7g/L L-苹果酸，1.0g/L β-NADPH(以上试剂均购于Sigma公司)，0.1% Triton X-100，0.1mol/L Tris HCl(pH7.6)。将所制标本用含0.1%Triton X-100的TBS充分漂洗后入作用液中于37℃孵育15～30min后用TBS终止反应，胚胎及新生大鼠整封染色肠管可放入4%多聚甲醛中4℃下长期保存。新生大鼠染色后的整封肠管还可行纵肌层铺片，连同其余染色后的铺片及切片标本经乙醇逐级脱水、二甲苯透明、DPX封固后观察。
4.图像分析及统计学处理
利用大恒公司的颗粒形状分析系统软件在监视器下对各组标本进行图像采集、预处理、颗粒分割、修补、二值化，最后设置阈值对图像中的NOS阳性神经元扫描测量，参考Cracco［4］的方法，以图像中颗粒的面积来表示NOS神经元胞体的大小，以单位面积中颗粒数来表示NOS神经元的密度，求出各个NOS阳性细胞的大小、密度及核／浆比。每张铺片标本随机任采集3～5个视野进行分析。
结果进行单因素方差分析，检验组间差异。
结 果
1.胚胎期NOS神经元的发育
NOS阳性神经元偶见于E13d鼠胚肠壁上，常单个散在，核／浆比大于1，突起短小，甚至不清楚(图1)；E16d，肠壁上可见N[1] [2] 下一页
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