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大鼠实验性脾虚证胃粘膜生长抑素mRNA原位杂交研究 |
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酶标记的抗地高辛抗体(来源同cRNA探针试剂盒，1∶1 000稀释)滴在切片上，用Parafilm膜覆盖，置湿盒内室温孵育4h。然后依次入0.05mol/L PBS，4次，每次5min;TSM12次，每次5min；TSM22次，每次5min。滴加NBT(硝基四氮唑蓝，400mg/L)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸，200mg/L)混合液，置湿盒内避光显色3～4h；入0.05mol/L PBS 漂洗2次，每次5min；双蒸水洗；甘油明胶封片。
4.原位杂交阴性对照
杂交液免去地高辛标记的cRNA探针或杂交前用RNaseA，37℃处理30min。
5.定量分析
5.1 杂交信号定量分析：将4组动物杂交阳性细胞用显微分光光度计(MPV-COM，BI，Leica)作定量测定。显微放大倍数为10×40。每组各测5例动物，每例随机测50个细胞，将测得的平均光密度值(MOD)作统计学分析。
5.2 细胞密度测定：普通光学显微镜10×10放大倍数下，用0.1×0.1mm的网格目镜测微尺，将测微尺的一侧置于胃粘膜的基底面，从胃幽门开始，连续测量10个测量尺面积的区域，计数这些区域的阳性细胞数，然后计算出细胞密度。所得数据作方差分析。
结 果
1.脾虚动物模型的复制
大鼠灌服致脾虚的中药煎剂后，第3d开始，喂药当日出现软便，次日恢复。随着造模时间延长，喂药当日出现溏便，次日可见软便。20d以后可见溏便脏尾、懒动、毛枯槁无滑、食欲减退、拱背、体重增长缓慢；随着时间延长，这些体症逐渐加重。脾虚组动物出现的这些体征与临床脾虚证所见相似。30d后，偶有动物死亡，但模型成功率一般不低于95%。灌服加味四君子汤后，大鼠出现的体征明显减轻并好转。溏便恢复较快、食量增加、毛光滑、体重增加较馔 。自然恢复组动物的体征不如治疗组恢复快。各组动物的体重见表1。对各组动物体重的统计学分析，结果为脾虚组动物体重明显低于对照组(P＜0.01)。中药治疗组动物体重增加高于自然恢复组，但与对照组相比有差异(P＜0.05)，说明未恢复到正常水平。
表1 4组动物的体重变化
Table 1 Changes of body weight in 4 groups animals
组别
group 动物只数
number of animals 体 重(g) (±s)body weight (g) 体重增长量(g)(±s)
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