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大鼠实验性脾虚证胃粘膜生长抑素mRNA原位杂交研究 |
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王秀琴 曾晓蓓 尚宏伟 王兴翠 杨 进
(首都医科大学组织学胚胎学教研室，北京 100054)
摘 要 为探讨脾虚证时生长抑素分泌失常的机理，用Wistar雄性大鼠24只，分为正常对照组、实验性脾虚组、自然恢复组和中药治疗组。4组动物同时处死，取胃制成恒冷箱切片，以地高辛标记的生长抑素cRNA为探针，用原位杂交法显示胃粘膜D细胞中的生长抑素mRNA，并对细胞内杂交信号进行了显微分光光度计测定。结果表明，与对照组相比，脾虚组胃粘膜D细胞mRNA表达增强，细胞密度增大。与自然恢复组相比，中药治疗组的D细胞mRNA的表达和细胞密度与对照组相近。本研究提示，脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA的高表达导致生长抑素合成增高，并对其意义进行了讨论。
关键词 生长抑素 D细胞 胃粘膜 实验性脾虚证 原位杂交 大鼠
近年来，对于脾虚证机理的研究，多以脾胃学说的“胃主受纳，主降；脾主运化，主升”；“内伤脾胃，百病由生”［1］理论出发。对脾虚证病人及实验性脾虚动物进行了消化吸收障碍机理的研究［2］。我们和一些学者的研究表明，动物实验和脾虚证病人消化道胃肠激素分泌出现异常［3，4］，可能是导致消化吸收障碍的重要原因。已有报道，在消化性溃疡、萎缩性胃炎时D细胞减少［5，6］。本室先前的工作证实，实验性脾虚证时胃幽门粘膜D细胞内生长抑素含量增多［3］。目前对脾虚证明胃肠激素分泌失常，尚无基因调控的实验依据。为此本研究用地高辛标记的生长抑素(SOM)mRNA探针，观察脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA表达，意图进一步探讨脾虚证生长抑素分泌失常的机理。
材料和方法
1.实验动物分组
成年雄性Wistar大鼠(Ⅱ级动物，中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供)24只，体重130～150g,随机分为4组：对照组5只，实验脾虚组7只，自然恢复组6只，中药治疗组6只。实验性脾虚组用破气苦降药和饮食失节相结合的方法［7］，并稍增加了大黄的剂量，致成脾虚动物模型。破气苦降药按厚朴：枳实：大黄为3∶3∶3的比例，冷水浸泡20min，煮沸20min，过滤浓缩成100%煎剂(含生药1kg/L)，隔日灌服，1日2次，每次3ml(药量为2g生药/100g体重)，喂药当日禁食，次日自由进食，喂养42d，致成脾虚证模型。对照组按脾组法灌服自来水，每次3ml,但饮食不限，饲养42d。中药治疗组为在致成脾虚证后，用加味加君子汤［7］治疗。汤剂成分的比例为炙黄芪：党参：伏苓：炒白术：炙甘草=2∶2∶2∶2∶1的比例，制成100%煎剂，隔日灌服，每日2次，每次3ml(药量相当于1.5g生药/100g体重)，正常饮食，喂养21d。自然恢复组按治疗组法灌服自来水、剂量及时间同治疗组。4组动物于1d\,21d和42d时称量体重。
2.取材和制片
4组动物同时取材，取材前禁食12h。于腹腔注射6%水合氯醛(0.5mol/100g体重)麻醉后，心脏取血处死。取胃沿胃小弯剪开，用生理盐水洗净胃内容物，沿胃长轴取宽约6mm、长约1.5cm的组织块，液氮骤冷，保存于-20℃～-40℃冰箱，次日制恒冷箱切片，厚10μm，裱贴于涂有含焦碳酸二乙酯(DEPC)的明胶的载玻片上，室温吹干，4%多聚甲醛固定20min,70%乙醇固定10min。然后进行原位杂交。
3.原位杂交程序(按Hoefler方法进行［8］
3.1 杂交前处理：切片依次入PBS(pH7.2)漂洗4次，每次5min;0.1mol/L甘氨酸(PBS配制)5min；0.4%Triton X-100(PBS配制)室温漂洗15min;1mg/L蛋白酶K 37℃消化30min;4%多聚甲醛5min;PBS漂洗2次，每次5min;0.25%乙酸酐(0.1mol/L，用三乙醇胺新鲜配制)室温10min;2×SSC 10min。
3.2 杂交：滴加0.5mg/L地高辛标记的生长抑素cRNA探针(上海第二军医大学组织学胚胎学教研室制试剂盒)的杂交液，覆盖Parafilm膜，置湿盒内于43℃杂交12～16h。 3.3 杂交后处理：杂交后的式片依次入4×SSC，37℃,15min;含RNase A的2×SSC(20mg/L)，37℃,30min,用以消化多余的探针；入1×SSC和0.5×SSC，37℃各15min；0.05mol/L PBS 室温洗3次，每次5min。将碱性酶[1] [2] 下一页
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