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人外周血树突状细胞在LAK抗HPBALL细胞中作用的研究 |
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邱立华** 缪继武 杨 宁 尹兰珍
(南京铁道医学院组织学胚胎学教研室，南京 210009;
**天津市肿瘤医院病理科，天津 300060)
摘 要 为探讨树突状细胞(DC)在LAK抗HPBALL细胞中的作用，采用多因素、多水平的杀伤试验，同时以光镜、电镜观察DC、LAK、HPBALL相互作用的形态特征及DNA断端标记法检测瘤细胞是否凋亡。结果表明：(1)DC无直接杀伤HPBALL作用。(2)5×105～1×107/L DC有增强不同E/T LAK杀伤活性的趋势，而1×107～5×107/L DC对LAK活性有抑制趋势。(3)DC、LAK杀伤HPBALL的最佳组合条件为：DC培养4d、浓度5×106/L，LAK E/T=10/1，rIL-2=0。(4)光镜、电镜下均可见DC的突起与LAK、HPBALL细胞紧密接触形成细胞簇。(5)DNA断端标记法显示瘤细胞呈末端脱氧核糖核酸转移酶阳性反应。结论：DC对LAK杀伤HPBALL活性具有双向调节作用。
关键词 树突状细胞 外周血 LAK HPBALL细胞 凋亡
树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种重要的免疫辅助细胞［1］，较强递呈抗原和辅助混合淋巴细胞反应［2］，在免疫相关性疾病发病中起重要作用。近年来，DC在肿瘤免疫中的作用受到人们的关注，大量动物和临床研究表明，DC可参与机体抗肿瘤免疫反应，然而有关这类研究仅局限于原位观察。我们试图观察人外周血DC在LAK抗HPBALL细胞中的作用、形态学特征并对其机制进行初步探讨。
材料和方法
1.人外周血DC分离
取浓集白细胞组分(南京红十字血液中心提供)1个单位，以Ficoll(自配)液分离单个核细胞(MNC)，洗涤，加用Verapamil(江苏省兴化县制药厂)5×10-2g/L，作用30min，继之以不连续Percoll(Pharmacia)密度梯度离心，取35%与50%界面层细胞，然后于含有人Ig(上海生物制品研究所)的克隆板上培养1h，轻轻吹打，收集非贴壁细胞，洗涤，即为DC组分，涂片4张，进行S-100蛋白免疫组织化学染色(ABC法，华美公司)。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。油镜下每片观察200个细胞，计数阳性率。
2.LAK细胞诱导
取MNC，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞浓度至3×109～5×109/L，同时加入rIL-2 1×106IU/L，于37℃、5%CO2培养箱中培养，第4d时补加rIL-2，继续诱导至第7d，收集LAK细胞。
3.DC抗HPBALL细胞
人急性T淋巴细胞性白血病细胞系(中国医学科学院血液学研究所提供)及调节LAK杀伤HPBALL细胞活性试验。
3.1 初筛试验：采用析因试验设计，探讨DC有无直接抗HPBALL作用及DC调节LAK杀伤HPBALL的较合适的浓度范围。
3.2 正交试验：在析因试验的基础上，进行正交试验，选用L27(313)正交表，探讨DC、LAK抗HPBALL的最佳组合条件。
4.细胞毒性检测
采用改良乳酸脱氢酶释放法［3］。细胞毒性检测数据以SAS软件进行方差分析和显著性检验。
5.光镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，涂片，进行S-100蛋白和瑞氏染色。S-100蛋白染色以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。
6.透射电镜标本制作
DC、LAK、HPBALL混合液，经3 000 r/min，离心30 min后，加入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，各级丙酮脱水，Epon 812包埋，超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅染色，H600型电镜观察。
7.原位细胞凋亡检测
DC、LAK、HPBALL混合培养4h后，离心，涂片，10%中性福尔马林固定，20 mg/L蛋白酶K消化15 min，置0.3%过氧化氢水溶液中20 min，加TdT和Biotin-ll-dUTP各1μl/片37℃标记60 min，封闭液50μl/片，后加Avidin-HRP 50μl/片，反应30 min，0.03%过氧化氢-0.5 g/L DAB显色10 min，苏木素复染，常规封片，镜检。
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