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抗APO |
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S分析结果显示，前组淋巴细胞凋亡的百分率分别为0.7%和1.0%；而SEB组淋巴细胞凋亡的百分率分别为1.6%和11.1%。上述两组细胞培养1d后经0.5μg/L和5μg/L抗APO-1单抗处理16h，PI染色后荧光显微镜下观察，发现无明显的凋亡细胞出现，并且SEB组细胞DNA断裂的百分率分别为1.3%和1.1%，而对照组仅为0.7%和0.8%；体外培养5d的两组细胞经上述浓度的抗APO-1单抗处理16h后，SEB组的凋亡细胞明显增多，并且与抗APO-1抗体的浓度呈剂量相关(图1，2)。而Zn2+的加入则抑制了抗APO-1单抗的上述作用(图3)。对照组细胞在体外培养5d后，虽然也经不同浓度的抗APO-1单抗处理，但细胞凋亡的百分率与培养1d相比无明显增高。
2.抗APO-1单抗可使SEB活化的淋巴细胞胞浆游离Ca2+浓度升高
体外培养5d的对照组和SEB组人外周血淋巴细胞经Frua-2/AM负载处理后，测其胞浆中游离Ca2+浓度分别为6.64±1.2nmol/L和18.6±5.4nmol/L。上述两组细胞经5μg/L抗APO-1单抗处理16h后，胞浆游离Ca2+浓度随上述抗体浓度增加而升高(图4)。
讨 论
图4 胞浆游离Ca2+浓度
Fig.4 Cytosolic free ［Ca2+］ of PBLC ----:control+5mg/L of APO-1
McAb(8.64nmol/L) -*-*:SEB+0.5mg/L of APO-1McAb(36.1nmol/L)
——:SEB+5mg/L APO-1 McAb(75.62nmol/L)
APO-1/Fas属TNF/NGF受体超家族成员，APO-1/Fas与其配体结合后可诱导APO-1/Fas阳性的细胞凋亡。Cifone［1］等研究表明APO-1/Fas与其特异性单抗结合后激活酸性鞘磷脂酶，后者可水解酸性鞘磷脂产生神经酰胺，最终导致细胞凋亡。但神经酰胺是否通过使胞内游离Ca2+浓度升高而导致细胞凋亡，目前尚未见报道，而Oshimi［2］实验表明，80%的FMO细胞(EB病毒诱导的B细胞系)表达Fas受体，当该受体与抗Fas抗体结合后，可使细胞浆Ca2+浓度升高，从而激活Ca2+/Mg2+依赖的内源性核酸内切酶，导致细胞DNA断裂，进而细胞凋亡。而Zn2+通过与内切酶上Ca2+位点竞争结合，从而阻断Ca2+/Mg2+依赖的内切酶活性，抑制细胞凋亡［6］。而Rouvier［3］认为Fas受体以Ca2+非依赖形式诱导细胞凋亡。那么超抗原活化的淋巴细胞凋亡是否与胞内Ca2+浓度变化有关，目前未见报道。我们前期的实验结果表明，超抗原SEB可诱导人外周血淋巴细胞表达APO-1受体，体外培养1d时开始升高，5d时达高峰［7］。为此，本实验选用不同浓度的抗APO-1单抗处理体外培养1d和5d的人外周血淋巴细胞。结果表明，抗APO-1单抗只诱导活化的淋巴细胞凋亡，并且在细胞表达APO-1受体最高时，随着抗APO-1抗体浓度的增加，细胞凋亡的百分数也随之增加，而Zn2+则抑制上述单抗的凋亡诱导作用。为了确定抗APO-1单抗诱导淋巴细胞凋亡形态学变化的可靠性，我们又采用了FACS检测，FACS是反应不同的DNA含量细胞所占的比例，如果有凋亡细胞则在正常细胞G1期峰前出现另一个单倍体峰，并且该峰所占的百分数就是细胞DNA断裂的百分数。此结果进一步证实了抗APO-1单抗可诱导SEB活化的淋巴细胞凋亡。并且抗APO-1单抗在诱导淋巴细胞凋亡的同时，可使细胞胞浆Ca2+浓度升高。对照组细胞由于很少表达APO-1受体，因此，抗APO-1单抗既不能诱导其凋亡；也不能使其胞浆游离Ca2+升高。由此推测，抗APO-1单抗与其特异性受体结合诱导的淋巴细胞凋亡可能是由于胞浆中游离Ca2+浓度升高，激活了Ca2+/Mg2+依赖的内源性核酸内切酶而导致SEB活化的淋巴细胞凋亡。
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