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抗APO |
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肖雪媛* 杨崇静** 杨贵贞
(白求恩医科大学基础医学院免疫学教研室，长春 130021；
**长春市第五医院，长春)
摘 要 为探讨抗APO-1单抗处理的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的淋巴细胞胞浆中游离Ca2+浓度的变化，用形态学观察、流式细胞光度术观测了鼠抗人APO-1单克隆抗体对SEB活化不同天数的人外周血淋巴细胞凋亡的诱导作用，同时采用Fura-2/AM荧光探针检测了APO-1单抗处理的淋巴细胞胞浆内游离Ca2+浓度。结果表明，抗APO-1单抗对SEB活化1d和对照组淋巴细胞无明显的促凋亡作用，但对SEB活化5d的淋巴细胞不仅可明显促进其凋亡，而且可使其胞浆游离Ca2+浓度升高，而Zn2+则抑制了抗APO-1单抗的凋亡诱导作用。由此可见，抗APO-1单抗与其特异性抗体结合后可能是通过使胞浆中游离Ca2+浓度升高，激活了Ca2+/Mg2+依赖的内源性核酸内切酶而导致SEB活化的淋巴细胞凋亡。
关键词 鼠抗人APO-1单克隆抗体 SEB Ca2+浓度 淋巴细胞凋亡
静息、成熟的淋巴细胞几乎不表达APO-1受体，但上述细胞经PHA刺激后可表达APO-1受体，并且该受体与其特异性抗体结合后可诱导APO-1+的细胞凋亡［1］。虽然目前认为APO-1是凋亡分子，但对Ca2+是否参与其凋亡诱导过程众说不一［2，3］。为此本实验探讨了抗APO-1单抗处理的SEB活化的淋巴细胞胞浆中游离Ca2+浓度的变化，为阐明APO-1诱导细胞凋亡的机制提供理论依据。
材料和方法
1.材料
健康人全血购自长春市中心血站；抗APO-1单克隆抗体由德国Krammer教授惠曾；碘化丙锭(PI)、RNaseA、Fura-2/AM及EGTA购自Sigma公司；金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)购自北京军事医学科学院五所；Triton X-100和rhIL-2购自天象人生物技术有限公司。
2.细胞培养及分组
全血加等体积Hank液，经淋巴细胞分层液离心后得单个核细胞，调细胞浓度为2×109/L。实验组加SEB(终浓度为1μg/L)和rhIL-2(终浓度为40IU/L)，对照组加40IU/L的rhIL-2，置37℃，5%的CO2孵箱中培养。
3.细胞凋亡的形态学观察
实验组和对照组细胞在体外培养1d和5d后，分别加入鼠抗人APO-1单抗(使其终浓度分别为5μg/L和0.5μg/L)，37℃培养16h，调细胞浓度为1×107/L，取50μl细胞悬液经cytospin甩片，80%甲醇固定30min，PBS洗涤3次，碘化丙啶(0.05% TritonX-100配制的50μg/L PI)4℃避光染色10min，甘油PBS封片后置荧光显微镜下观察。
4.细胞DNA断裂的百分率测定
培养1d和5d的细胞，分别加鼠抗人APO-1单抗(使其终浓度分别为0.5μg/L和5μg/L)，37℃培养16h后，调细胞浓度为1×108/L，经碘化丙啶染色后测定其细胞DNA断裂的百分率；另外1组培养5d的细胞在加抗APO-1单抗同时加ZnCl2(终浓度为5nmol/L)，37℃培养16h后测定细胞DNA断裂的百分率。测定方法参考文献［4］。
5.细胞胞浆游离Ca2+浓度的测定
实验组和对照组培养5d的细胞，分别加鼠抗人APO-1单抗(终浓度分别为5μg/L和0.5μg/L)，分别经Fura-2/AM负载处理后，测定胞浆游离Ca2+浓度参考文献［5］，采用P-E 5050荧光磷光发光分光光度计测定荧光强度。
结 果
1 抗APO-1单抗促进SEB活化的淋巴细胞凋亡
图3 细胞DNA断裂的百分率
Fig.3 Percentage of DNA fragmentation of cells a:SEB+0.5μg/L of APO-1
McAb; b:SEB+5mg/L of APO-1 McAb; c:SEB only; d:SEB+5μg/L
of APO-1 McAb+ZnCl\-2+(5nmol)
对照组和SEB刺激1d和5d的人外周血淋巴细胞，碘化丙锭染色后FAC[1] [2] 下一页
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