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胃粘膜细胞系GES |
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王永信 柯 杨
(北京医科大学肿瘤研究所，肿瘤遗传室，北京，100034)
摘 要 为了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律，选择了11个多态微卫星DNA标记(MS)，采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术对本室建立的永生性胃粘膜细胞系GES-1的不同代数(P8、P21、P58、P100)及化学致癌剂转化的GES-1细胞系MC进行了MS的微卫星DNA不稳定(microsatellite instability, MSI)及杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)分析。结果发现，8代以前的细胞与正常细胞相比，有较高的MSI和LOH(4／11)，而从8代以后随传代时间延长降至1／11，并基本稳定在这一频率。经过化学致癌剂处理的MC细胞并未出现显著增加的MSI和LOH。结果提示，胃粘膜细胞系中，高频率的MS突变(MSI和LOH)可能是SV40整合到细胞基因组中的结果，与MNNG剂无关，细胞系建成后，具有相对稳定的遗传状态。
关键词 细胞系 微卫星DNA不稳定 杂合性缺失
目前，离体细胞培养在肿瘤研究中仍然占有重要地位，人类恶性肿瘤80%以上起源于上皮细胞。GES-1细胞系是柯杨等［1］1992年建立的可在体外长期稳定传代，且在裸鼠中不致瘤的人胃粘膜永生性细胞系。MC细胞系［2］是用不同剂量的化学致癌剂甲硝基亚硝胍(MNNG)对人胃粘膜永生性细胞系GES-1的21代进行处理获得，其细胞形态发生了改变，集落形成率增加，获得停泊非依赖性生长的特性。GES-1和MC细胞系已广泛用于离体癌变的研究［3］，体外培养的细胞，其遗传稳定性一直是广为关注的问题，而人们对此知之甚少。为了明确这一问题，我们对GES-1和MC细胞系进行MSI和LOH观察，以了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律。
材料和方法
1.实验材料
GES-1细胞系：分别选择其第8、21、58、100代(P8、P21、P58、P100)和MC(第53代)细胞系。
2.细胞系培养及DNA提取
不同的代数(P8、P21、P58、P100)GES-1细胞系和经化学致癌剂处理后的MC细胞系，按本室自建的低血清方法培养。培养液的制备见文献［4］。贴壁细胞长到80%满后，用PBS或生理盐水洗2次，置于1.5ml Eppendorf管中，分别加入1ml Hert buffer和100μl蛋白酶K，于37℃过夜，酚-氯仿-异戊醇抽提，紫外分光光度计定量后备用。
3.PCR反应
11个MS引物购自美国Research Genetics Inc(表1)，20μl PCR反应体系中加入基因组DNA 10～100ng，上、下游引物各10pmol/L,10×PCR buffer 1μl 50～200μmol/L 4×dNTP,0.5IU Taq DNA聚合酶。经94℃30s、50～60℃ 30s、72℃ 30s 35个循环，72℃5min。
4.结果判定
5μl PCR产物94℃变性5min，上样于8%聚丙烯酰胺凝胶1×TBE，25℃或4℃，恒功率45W，待二甲苯青接近下缘时，关闭电源，取下凝胶。银染后观察结果。将细胞系标本与其相应的母本DNA PCR产物同时上样比较，若细胞系的某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则记为LOH；若细胞系的条带与正常母本相比出现，则等位基因条带的增多或大小改变记为MSI。实验结果采用X2检验。
结果和讨论
我们对SV40转化的GES-1细胞不同代数(P8、P21、P58、P100)和化学致癌剂进一步诱变的GES-1细胞MC(第53代)，以原代细胞的DNA作为正常对照。分别检测了11个位点的MSI和LOH发生频率，结果见表2。D1S243、D2S123、D11S904、D5S407 4个位点均未发现MSI和LOH，而D3S1067和D4S414两位点各阶段细胞系均为LOH。D2S119和D2S136位点分别在P8和P21细胞为正常，而P58后均有突变发生(MSI或LOH)。细胞的多数突变(4／11)发生在8代以前，在这之后检测的3个代数MSI和LOH出现率逐渐降低(1／11)。GES-1细胞在21代时经MNNG处理后，命名为MC细胞，后者也未因化学致癌剂[1] [2] 下一页
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