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T细胞无能与凋亡关系初探 |
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免疫应答调节中具有重要作用。本文在体外诱导了无能T细胞模型，研究了无能T细胞与凋亡的关系，并对凋亡的机制进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 健康人外周血购自上海市血液中心; CTLL细胞株由本室保存。
1.1.2 主要试剂 淋巴细胞分层液:上海试剂二厂;TT:中科院上海细胞生物学研究所叶敏教授惠赠;抗B7-1单抗(BB1单抗)、抗CD3单抗(G19-4):由美国华盛顿大学E A Clark教授惠赠;CsA:瑞士Sandoz Pharmaceuticals公司产品;AET、丝裂霉素C(mito-C)、PHA-P、PMA、A23187:均为Sigma公司产品;IL-2:华新生物工程公司产品;细胞总RNA提取试剂盒Trizol、RT-PCR试剂盒购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 APC及T细胞的分离 采用AET法。
1.2.2 抗原特异性无能T细胞的诱导 APC经mito-C处理后，再与TT(10 μg/ml)或PPD(15 μg/ml)培养过夜，洗涤3次。将APC与T细胞以1∶3的比例混合，加入抗B7-1单抗(10 μg/ml)和CsA(500 ng/ml)，培养3 d，收集细胞，上淋巴细胞分层液，分离T细胞。
1.2.3 激活剂对无能T细胞的活化诱导 将无能T细胞及外周血T细胞加入96孔板(3×106/孔)，然后加入PHA(3 μg/ml)和IL-2(50 U/ml)，培养16 d，用淋巴细胞分层液除去死亡细胞。活细胞洗涤后，再分别加入PHA(10 μg/ml)、抗CD3单抗(10 μg/ml)、PMA+A23187(各10 ng/ml)培养24 h，收集细胞，FACS分析凋亡细胞。
1.2.4 凋亡细胞的检测 1×106 个细胞，加入1 ml PBS，慢慢滴加2 ml冰冻无水乙醇，混匀，固定细胞，4℃保存。 PI染色前，先用PBS洗涤，去除固定液，加入200 μl RNase A 37℃，水浴30 min，再加入800 μl PI染色液混匀，至4℃避光30 min，上FACS分析结果。
1.2.5 Fas mRNA表达的检测 总RNA抽取及逆转录按Gibco试剂盒说明进行。Fas引物序列如下:5 -GATTGCTCAACAACCATGCT-3 3 -GTTTCGAACCA-GATCTCACT-5 。PCR条件:94℃ 变性3 min,94℃ 1 min,60℃ 1 min,72℃ 1 min,循环35次,72℃ 7 min，同时扩增β-actin为内参照。
2 结果
2.1 抗B7-1单抗和CsA联用诱致抗原特异性的T细胞无能 APC细胞处理TT抗原后，抗B7-1单抗和CsA联用可阻断T细胞的增殖，抗B7-1单抗和CsA单独处理均不能阻断T细胞的增殖。对T细胞分泌IL-2进行了动态检测，结果发现T细胞接受抗原刺激后，IL-2分泌48 h达高峰，抗B7-1单抗和CsA均能抑制IL-2的产生，两者联用可阻断IL-2的分泌(表1)。
2.2 无能T细胞的凋亡的观察 新鲜分离外周血T细胞，以10% FCS 1640维持培养，分别于1、3、5、10 d检测细胞凋亡的情况，发现在不同时相均未发生明显凋亡。无能T细胞在上述时相细胞凋亡的百分率依次为2.16％、11.28%、19.27%、41.22%，表明无能T细胞在体外是逐渐发生凋亡的。当加入100 U/ml IL-2一起培养，无能T细胞未发生明显凋亡。
2.3 不同激活剂对无能T细胞凋亡的影响 外周血T细胞及无能T细胞经激活剂活化诱导后，检测Fas mRNA表达，发现外周血T细胞及外周血T细胞及无能T细胞经PHA激活，再由PHA(10 μg/ml)、PMA+A23187 (各100 ng/ml)和抗CD3单抗(10 μg/ml)活化诱导，24 h可发生凋亡，凋亡的百分率依次为71.91%、31.70%、39.34% 。无能T细胞激活诱导后亦发生凋亡，凋亡百分率分别为34.67％、21.27％、15.07％，其凋亡的程度低于外周血T细胞。
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