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创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制研究 |
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对此进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物及致伤模型 Balb／c小鼠(本校动物所提供)，雌雄各半，6～8周龄，18～22 g。随机分为正常对照、伤后1、2、4、7、10 d共6组，每组10只动物。参照文献［2］制备小鼠双后肢闭合性创伤模型。
1.2 T淋巴细胞的分离与活化 按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法［3］分离脾细胞中的T细胞。酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度＞92%，台盼蓝拒染试验证明分离出的T细胞活力＞95%。将T细胞以RPMI1640培养液(Gibco公司)调成5×106 ml-1，加入终浓度为10 μg/ml的ConA(Sigma公司)，于37℃、5%CO2培养箱中孵育以活化T细胞。
1.3 活化T细胞指标测定
1.3.1 T淋巴细胞转化、IL-2活性、IL-2Rα测定 参照文献［4］进行。3H-TdR由中国科学院上海原子能研究所提供，IL-2标准品及CTLL2细胞株由第三军医大学免疫教研室提供，大鼠抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体由Boehringer Mannheim公司提供，FITC标记兔抗大鼠IgG单克隆抗体由华美生物工程公司提供。
1.3.2 IL-2 mRNA，IL-2Rα mRNA测定 T细胞经活化10 h后收集细胞，以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿／异戊醇法提取细胞总RNA，参照文献［4，5］测定IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA水平。所用的cDNA探针包括：1.0 kb片段的IL-2 cDNA和0.92 kb片段的IL-2Rα cDNA(ATCC公司)。地高辛随机引物标记药盒由Boehringer Mannheim公司提供。
1.3.3 cAMP、cGMP含量、游离钙(［Ca2+］i)浓度、蛋白激酶C(PKC)活性测定 T细胞经活化2 h后收集细胞，参照文献［6-8］处理细胞并测定cAMP、cGMP含量、［Ca2+］i浓度及PKC活性。
1.4 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T细胞上述指标的影响 在正常T细胞活化培养的同时，加入各组巨噬细胞(占细胞总数10%)，测定各指标变化情况。
1.5 去除脾细胞中巨噬细胞对上述指标的影响 按常规制备脾细胞悬液，置于塑料平皿中，于培养箱中孵育2 h使巨噬细胞贴壁，收集非粘附细胞并调至原浓度，参照活化T细胞的方法，活化脾细胞及非粘附细胞，测定上述指标的变化。
1.6 统计学处理 结果以平均值±标准差(±s)表示，用t检验进行显著性分析。
2 结果
2.1 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用 于正常小鼠T细胞培养系统中，加入正常对照组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有轻微刺激作用，但加入创伤各组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有不同程度的抑制作用，以伤后1、2、4 d 的抑制作用最为明显，伤后10 d尚未完全恢复至正常对照水平(表1)。
2.2 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响 与正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外对正常T淋巴细胞IL-2的生成、IL-2Rα表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均具有明显的抑制作用(表2)。
2.3 各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响 和正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP／cGMP比值，并明显降低细胞内［Ca2+］i浓度及PKC活性(表3)。
2.4 去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响 去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对脾细胞IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使4项指标的水平明显升高，但并不能使之完全恢复至正常(表4)。
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