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逆转录病毒载体介导的人白细胞介素10在大鼠心肌细胞的表达 |
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The retroviral vector PLX(hIL-10)SN shall lay foundation for researching hIL-10 mechanism and its application for curing heart diseases.
Key words Gene transfer Retroviral vector Human interleukin 10 Rat cardiomyocytes
白细胞介素10是T辅助细胞产生的以抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子。它具有抑制Th1细胞亚群细胞因子γIFN，IL-2,TNF-α，GM-CSF，LT等的合成；还具有抑制单核细胞中细胞因子如IL-1α，TNF-α，GM-CSF等合成［1］；抑制巨噬细胞产生活性氧的中间体，抑制单核巨噬细胞依赖性NK细胞合成IFNγ和TNFα，抑制单核细胞HLA-II类抗原DR，DP，DQ的表达［2］；抑制B7，细胞粘附分子ICAM-1的表达［3］。动物实验显示IL-10能抑制感染性休克小鼠的TNF-alpha和IL-1的高表达，降低死亡率［4］；用IL-10处理的鼠郎罕氏细胞诱导了T细胞的无应答［5］；以上这些特性表明IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用，用于治疗免疫介导的炎症性疾病和用于抑制排斥反应具有广阔的应用前景。本实验建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素10的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为今后研究hIL-10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒，菌株和细胞 大鼠表达人白细胞介素10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN由本室构建［6］；空白载体pLXSN，PA317，NIH3T3：军事医学科学院；Wistar大鼠：中山医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要酶和试剂 RT-PCRkit：Promega；PCRkit：华美公司；DOTAP：Boehringer Marmnnheim；G418，DMEM／F12：GIBCO；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，hIL-10 ELISA kit：深圳晶美公司。
1.2 方法
1.2.1 重组逆转录病毒的包装和重组病毒感染滴度测定 将重组质粒pLX(hIL-10)SN和空白质粒pLXSN用DOTAP法导入逆转录病毒包装细胞PA317，培养72 h后，换含400 μg／ml G418的10%新生牛血清进行筛选；待抗G418抗性克隆形成后冻存于液氮中备用。将抗性克隆从液氮取出复苏，待细胞达70%～80%左右汇合时，收集其上清液，以102～104的倍数做系列稀释后，分别感染NIH3T3细胞(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，感染3 h后换液，继续培养72 h后用含800 μg／ml G418的培养基培养14 d。以抗性克隆上清液的稀释倍数乘以存活的抗G418的细胞克隆数为重组病毒感染滴度。单位为CFU／ml(集落形成单位／毫升)。
1.2.2 大鼠心肌细胞的转染 按文献［7］的方法培养Wistar大鼠心肌细胞。待细胞达60%～80%左右汇合时，分别加入上述抗G418抗性克隆pLX(hIL-10)SN和pLXSN上清(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，3 h后换为10%新生牛血清DMEM／F12进行培养；72 h时换为含800 μg／ml G418的选择性培养基培养；3 d后取细胞分别提取DNA和RNA。
1.2.3 目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞表达的检测
1.2.3.1 目的基因hIL-10转移至大鼠心肌细胞的检测 取上述转染的大鼠心肌细胞，PBS离心洗涤3次，按文献［8］的方法提取DNA作PCR，以一对引物
图1 转染大鼠心肌细胞 DNA的PCR检测
Fig.1 PCR detection of transfected rat cardiomyocytes DNA
Note:Lane 1.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLXSN vector)；Lane 2.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLX(IL-10)SN vector):679 bp；Lane上一页 [1] [2] [3] 下一页
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