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病毒激活巨噬细胞产生的一氧化氮与细胞毒的关系 |
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用于肿瘤生物治疗的研究颇为活跃［1］。一氧化氮(NO)是一种简单而不稳定的自由基，很多细胞均有合成NO的酶，但直到80年代人们才开始认识NO的生物学作用，尤其与巨噬细胞的活性有着密切关系［2］。新城鸡瘟病毒(Newcastle Disease Vius)具有对人不致病等优点，故用于肿瘤生物治疗的研究报道较多［3］。尤其最近我们发现用其亚系(NDV-L)可以激活小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal Elicit macrophage, PEMφ)，产生TNF α和MHC限制性和MHC非限制性的细胞毒效应，这无疑为病毒应
1 材料与方法
1.1 病毒株 NDV-L的血凝效价(HAU 1∶1 280)，半数鸡胚感染量(EID50)为 10-8／0.2 ml，引自中国兽医监察所，由我室常规扩增定量。
1.2 肿瘤细胞株 H22为小鼠肝癌细胞系；P815为小鼠肥大细胞瘤；K562为人红白血病细胞系；Raji为人Burkit淋巴瘤细胞系；均引自大连医科大学肿瘤研究所。
1.3 主要药品与试剂 亚硝酸钠(北京刘李店化工厂)、对氨基苯磺酰胺(北京东四化学试剂商店)、双氢二乙胺(NED，北京芳草医药化工研制公司)、Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和0.1% NED 1∶1混合，用前新鲜配制)、BCG(卡介苗，卫生部上海生物制品研究所)、LPS(细胞内毒素，和光纯药工业株式会社)、MTT(噻唑蓝，华美生物工程公司北京分公司)、羊抗兔-FITC抗体(军事医学科学院)、NG-单甲基-L-精氨酸(NO酶抑制剂，NG-MMA，邦定生物制品公司)。
1.4 动物 615纯系雌性小鼠，引自中国医学科学院实验动物中心。
1.5 小鼠腹腔巨噬细胞(PEMφ)的制备 参见文献［5］。取健康615系小鼠腹腔注射3%硫乙醇酸钠2 ml／只，3 d后用冷PBS冲洗腹腔收集细胞，离心破红细胞后用RPMI 1640使用液在37℃，5%CO2条件下培养4 h(调细胞浓度为1×107 ml-1)，即为PEMφ。
1.6 NDV-L对PEMφ感染性测定 将NDV-L(HAU 1∶1 280，EID50为 10-8/0.2 ml)与PEMφ(1×106 cells)于37℃，5%CO2条件下作用不同的时间(1、2、4、8、24、48 h)后，加兔抗NDV-L抗体(本室制备)于37℃，5%CO2条件下30 min，再加羊抗兔IgG-FITC抗体继续作用30 min进行FACS分析。
1.7 一氧化氮的诱导及含量测定
1.7.1 NDV-L诱导小鼠PEMφ释放NO 将小鼠PEMφ贴壁培养后用NDV-L感染2 h，洗去未感染病毒，在RPMI 1640使用液中继续培养24 h，收集上清贮存-30℃待测NO含量；将未与NDV-L作用的PEMφ上清作为阴性对照组；将2×106 U的BCG 1 ml与PEMφ先作用24 h，洗涤后再加LPS (10 μg/ml)同样培养条件下作用2 h上清作为阳性对照组。以(BCG-LPS-NO)表示。
1.7.2 NO含量测定 采用Griess方法。取96孔平底板一块，将亚硫酸钠标准液释释为320、160、80、40、20、10和5 μmol/L 7个浓度，加入96孔板，每份样品3个复孔；将待测样品上清和空白对照(只加蒸馏水)加入另起一行的96孔板中，所有样品均加0.1 ml，均为3个复孔；然后各孔加入Griess试剂0.1 ml，室温显色10 min后用酶联仪上570 nm波长测OD值，用计算和绘制标准曲线即可推算出NO含量。
1.8 不同效价NDV-L诱导不同小鼠PEMφ产生NO 将效价为1∶1 280的NDV-L稀释成不同浓度(EID5010-2～EID5010-9)，取0.2 ml分别与PEMφ(5×106个)作用2 h后，将未吸附的NDV-L洗掉后再以无血清RPMI 1640培养液培养24 h，收集上清用Griess方法测NO含量。
1.9 细胞毒活性测定 按文献［6］方法。以H22、P815、K562和Raji细胞为靶细胞(1×105 ml-1)，NDV-L-PEMφ和BCG-LPS-PEMφ作效应细胞(效／靶为20∶1)。效靶细胞作用24 h后加入MTT试剂，在595 nm波长下测OD值，按以下公式计算细胞毒活性：
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