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舒喘灵对缺氧大鼠肺动脉高压和肺组织肾上腺素能 2受体mRNA表达的影响 |
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eta;受体mRNA的变化及药物作用后的影响报道极少。
本文研究肾上腺素β2受体激动剂舒喘灵(羟甲叔丁肾上腺素，salbutamol)对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用和对肺组织β2受体mRNA表达的影响，以期探明当缺氧使肺β2受体已下降情况下，长期应用β2受体激动剂是否会使β2受体进一步下调以至影响防治效果，抑或仍能奏效，同时肺β2受体mRNA发生何种变化，从而在分子水平阐明药物作用环节，为缺氧性肺动脉高压的防治提供启示。
材料与方法
一、动物缺氧与药物处理：
缺氧性肺动脉高压模型按薛氏法复制［1］，雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g(±s)，置于自制能自动调节舱内氧浓度的常压缺氧舱内(10%O2)每天6 h，每周6 d，间断缺氧4周。缺氧期间每次缺氧前后灌胃给予舒喘灵(每次2.5mg/kg,2次／d)。另设常氧对照和常氧加药物对照组，为选择合适剂量，事先还选用舒喘灵2.5，5，12.5 mg/kg 3种剂量比较其效果。
二、血流动力学测定：
大鼠用12%乌拉坦麻醉(1 mL/100g BW,ip)，由颈外静脉插管经右心室到达肺动脉，连至RW 6000多导生理仪记录右心室压和肺动脉压。颈动脉插管纪录体动脉压。
三、血气分析和心室重量测定：
经动脉插管取血作血气分析。开胸取心肺，肺置液氮中保存。心脏剖成右心室壁(R)，和左心室壁加室间隔(L＋S）两部分，分别称重，计算R／L＋S值作为有无右心室肥厚的指标。
四、肺组织RNA提取和电泳鉴定：
将冷冻肺组织置水上剪碎后，用异硫氰酸胍－酚－氯仿法提取肺组织RNA［3］。用Tris－EDTA溶解RNA，－20℃保存［7］。取RNA在含甲醛的琼脂糖凝胶上电泳和测定OD 260和OD 280算出RNA浓度。
五、多聚酶链式反应和特异性条带放射性测定：
1.引物设计：按Bucrlan等［8］报道的大鼠β2受体的基因序列设计和合成一对寡核苷酸引物(由中国科学院微生物研究所合成)。上游引物(5′－ATCGAGACCCTGTGCGTGA－3′)与β2受体cDNA序列361－379碱基对应。下游引物(5′－CATAGGCCTGGTTCGTGAA－3′)与581－600碱基对应。产生240bp的DNA片断。
2.逆转录反应：在总体积为10μL的缓冲液(50mmol/L Tris.HCl pH8.3，8mmol MgCl2，30mmol/L KCl，10mmol/L DTT)中进行。另加dNTP 0.2 mmol/L，10U RNA酶抑制剂，25 U MMLV逆转录酶，下游引物100pmol，样本RNA 1μg，37℃水浴反应1 h，95℃水浴5 min，灭活逆转录酶。
3.多聚酶链式反应：在总体积为50μL的缓冲液(10mmol/L Tris.HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2)中进行，另加1U Tag酶，上游引物100 pmol，［α－32P］－dCTP 1.85×107Bq(11.1×1010Bq/mmol)，逆转录产物3μL。95℃预变性5 min，然后按95℃变性1 min，60℃退火和延伸1 min，循环30周期，最后1次延伸持续7 min。
4.特异性DNA带放射性测定：多聚酶链式反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相。将特异的240bp条带切下，放入加有0.4mL3%双氧水的闪烁杯中，沸水浴10 min后加5 mL甲苯闪烁液，测定其放射性，以每分钟计数值(counts.min－1）表示，以此反映β2受体mRNA的含量。
六、引物特异性鉴定：
将含有经克隆的β2受体cDNA质粒DNA与样本RNA逆转录产物用同一对引物进行扩增，扩增产物经电泳后照相。
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