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肺动脉与冠状动脉内皮环氧合酶及TXA2合酶基因表达的差异 |
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动脉缺氧反应中起重要作用的血管活性物质，近年发现PGs生成的限速酶，即环加氧酶有二种亚型：环氧合酶－1（cyclooxyenase-1,COX－1）和环氧合酶－2（cyclooxyenase－2，COX-2)，两者的生理和病理生理作用尚待研究。本研究探讨在常氧和缺氧下肺动脉与冠状动脉内皮细胞的COX-1、COX-2的基因表达和PGI2、TXA2生成的差异，为了解肺动脉与冠脉血管对缺氧反应差异的机制提供线索。
材料与方法
(一)内皮细胞培养及分组：猪肺动脉内皮细胞培养及猪冠状动脉内皮细胞分离依本室方法［1，2］。内皮细胞Ⅷ因子免疫染色鉴定。第3代内皮细胞用于实验。内皮细胞培养分2组：(1)常氧对照组：在CO2培养箱中培养24 h。(2)缺氧组：在含95%N2，5%CO2混合气的自制密封小室内37℃培养24 h。
(二)cDNA探针制备：COX cDNA由美国密西根大学Dewitt博士惠赠。血栓素A2合成酶(thromboxane synthase,TXS) cDNA质粒由美国德克萨斯州立大学Wang博士惠赠。被转染到大肠杆菌JM109中并扩增，经碱变性法提取质粒DNA，经酶切电泳，冻融法回收COX-1，COX-2及TXS cDNA探针。
(三)细胞总RNA的提取与斑点杂交(dot blot)：细胞总RNA的提取采用一步法进行［3］。琼脂糖-甲醛电泳可见清晰的18S和28S条带。取25 μg细胞样品RNA点样于硝酸纤维膜。冻融法回收cDNA片断。用随机引物标记法以［α-32P］-dCTP标记COX-1，COX-2和TXS cDNA片断作为杂交探针。将杂交膜放入预杂交液中42℃杂交24 h，按常规洗膜。-70℃曝光，显影后经TJY-300型全自动图像分析仪测定斑点的光密度以确定COX和TXS mRNA的相对量。
(四)条件培养液中TXB2和6-keto-PGF1α含量测定：应用放射免疫法测定TXA2和PGI2的稳定代谢产物血栓素B2(TXB2)和6-酮一前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)含量。由江苏省血栓研究所提供试剂盒，放免测定结果以±s表示，进行组间t检验。
结果
一、常氧和缺氧时肺动脉内皮细胞(pulmonary endothelial cells,PAEC)和冠脉内皮细胞(coronary artery endothelial cells,CAEC)中COX-1和COX-2mRNA的含量以及TXS mRNA含量：
培养的PAEC和CAEC在常氧下均有COX基因表达，PAEC中COX-2 mRNA含量较高，为CAEC的1.5倍。而COX-1 mRNA含量在两种内皮细胞中无差异。缺氧时PAEC和CAEC COX-1 mRNA水平均升高，分别为其常氧对照组的2.5倍和3倍，COX-2 mRNA含量仅在PAEC中明显升高，达对照组的1.6倍，缺氧对CAEC的COX-2 mRNA含量无明显影响(图1)。
二、培养的PAEC和CAEC在常氧下均有TXS基因表达。缺氧对两者TXS mRNA水平均无明显影响。
三、常氧和缺氧时PAEC和CAEC条件培养基中6-keto-PGF1α和TXB2的含量：
从表1可见，在常氧下两种内皮细胞均有6-keto-PGF1α和TXB2生成，并且PAEC的6-keto-PGF1α的生成量明显高于CAEC，但两者生成TXB2量无明显差异。缺氧可使两种内皮细胞的6-keto-PGF1α生成显著增加，PAEC的增加量相对少于CAEC者，而缺氧对两种内皮细胞的TXA2的生成无明显影响，故PAEC的缺氧条件培养液中6-keto-PGF1α/TXB2比值明显低于CAEC者。
表1 PAECs和CAECs在常氧或缺氧下培养24 h时培养基中6-keto-PGF1α和TXB2的含量
Tab 1 6-keto-PGF1α and TXB2 content in medium of PAECs
and CAECs cultured under normoxia or hypoxia for 24 hours (ng/L, ±s, n=3)
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