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血管紧张素 对血管内皮细胞整合素 3表达的影响 |
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，依不同Ang Ⅱ的浓度(10-5～10-8mol/L)分为5组，每组刺激物均作用18 h，同时设置阳性对照组(PMA 100 ng/mL)和正常组对照(未加任何刺激物)。细胞-ELISA方法根据北京中山生物技术有限公司提供的免疫组化染色SP试剂盒改进而成，简述如下：细胞融合生长后加入刺激物作用18 h→PBS(pH7.4)洗涤2遍→0.25%戊二醛室温固定10 min→PBS冲洗3遍→加5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)室温10 min→倾去血清，加1∶100稀释鼠抗人β 3单抗(购自法国IMMUNOTECH公司)50 μL， 4℃过夜→PBS冲洗 5 min×3次→滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min→PBS冲洗3min×3次→加入辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育30 min→PBS冲洗3 min×3次→OPD显色→4 mol/L H2SO4终止反应→酶标仪490 nm波长处测OD值。每一浓度点设计3个复孔，并重复实验3次。
(三)反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)：
1.引物的准备：根据文献中整合素β 3 cDNA和GAPDH cDNA的核苷酸顺序设计了两对寡核苷酸引物(上海生工生物工程有限公司合成)，前者上游引物序列：5’-GTG CTG ACG CTA ACT GCA C-3’，下游引物序列：5’-CAT GGT AGT GGA GGC AGA GT-3’［3］，后者为内参照，其上游引物序列：5’-CCA TGG AGA AGG CTG CC-3’，下游引物序列：5’-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3’［4］。
2.细胞内总RNA的提取：经Ang-Ⅱ(10-6mol/L)作用18 h的第3代HUVEC和正常组对照组用一步快速热酚抽提法提取细胞总RNA［5］。取2 μL RNA进行快速琼脂糖凝胶电泳鉴定照相。同时用紫外分光光度计测260 nm和280 nm的紫外吸收值，计算RNA的浓度和纯度。
3.RT-PCR反应采用Promega公司的Access RT-PCR Introductory System,按产品说明进行操作，细胞总RNA的量均为1 μg，将整合素β 3和GAPDH的引物放入同一管内扩增，二者浓度均为1 pmol/μL。反转录条件下48℃水浴中45 min，然后直接进行PCR反应，反应条件为：94℃ 5 min→94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min→72℃ 10 min。循环圈数分别采用22、24、26、28、30，并根据结果选择最适循环圈数避免PCR反应的平台期。RT-PCR反应重复进行两次。
取4 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，用图像分析处理系统(pharmacia)进行辉度扫描，比较AngⅡ组和对照组整合素β3/GAPDH辉度的比值。
(四)数据的统计处理：数据以均数±标准差表示，用t检验判断均数差异显著性。
结果
一、不同浓度Ang-Ⅱ对HUVEC表面整合素β3表达的影响：
不同浓度Ang－Ⅱ(10-8～10-5 mol/L)作用于2～5代HUVEC 18h后，细胞表面整合素β3蛋白表达均有增加(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。根据Ang-Ⅱ对单核细胞和内皮细胞粘附作用及对整合素β3蛋白表达的影响结果，选择10-6 mol/L Ang-Ⅱ和18 h作为反应的浓度点和时间点，进行后续实验。如图1所示。
Fig 1 Effect of different concentration of Ang-Ⅱ on the expression of integrin β3 of HUVEC(±s, n=9)*P＜0.05, **P＜0.01，vs control
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