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人胚胎胰岛分泌白细胞介素6的动力学研究 |
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一、样品的采取和胰岛细胞的分离培养：
实验所用10例为死亡2 h以内的水囊引产胎儿。胎龄7～8个月，按常规方法，无菌取出胰腺，胰岛细胞的制备同文献［4］。胶原酶V型为Sigma公司产品，活性为510 U/mg。
二、人胚胎胰岛细胞培养上清的制备及细胞成活率检测：
将胰岛悬液浓度调为5×108／L，种入24孔板，分不同时间收获上清，每次3复孔，分别测定上清中IL－6、胰岛素和胰高血糖素的含量。并将细胞进行胎盘蓝染色，计数各点的细胞成活率。
三、IL-6单克隆抗体中和活性测定：
IL-6单抗为本室建立的杂交瘤细胞株，经过纯化后纯度为98%以上，经实验证明与rhTNF、rhIFN、rhGM-CSF、rhG-CSF及rhIL-2均无交叉反应。用培养不同时间的胰岛培养上清，加入不同浓度的IL-6 McAb(0.85～12.5mg/L)，同时设rhIL-6 4×104U/L作为阳性对照。每个样品设3复孔，用MTT法测定中和活性，中和活性以中和百分数(%)表示。
四、体外葡萄糖刺激实验：
将新鲜分离的胚胎胰岛细胞用无Ca2＋、Mg2＋的Hanks液洗涤3次，分别加入高糖(即16.7 mmol/L葡萄糖)、低糖(1.67 mmol/L葡萄糖)和RPMI 1640培养液，各3复孔，置CO2培养箱孵育，分别在2 h和4 h收获上清，测定上清中IL-6、胰岛素含量。
五、胰岛素抽提实验：
将新鲜分离的胰岛细胞用Hanks液洗涤后，反复冻融3次，加入酸化乙醇(0.18 mol HCl:无水乙醇=1∶3)，置4℃过液后离心取上清，测定胰岛素含量。
六、IL-6生物活性检测：
IL-6生物活性检测照文献［5］进行，略有改动。IL-6依赖细胞株MH 60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品，已用rhIL-6标准品(美国NIH产品)进行标定。用MTT比色法测定A570～630值，用概率单位法计算各样品不同稀释度的生物反应率，最终计算出IL-6的生物效价(mU/胰岛)。
七、胰岛素和胰高血糖素测定：
用北京原子能研究所提供的125?I-胰岛素放射免疫分析药盒和胰高血糖素放射免疫测定盒测定。胰岛素的标定单位为IU/L，胰高血糖素的标定单位为ng/L。
结果
一、人胚胎胰岛自发分泌IL-6的时间动力学：
1.人胚胎胰岛体外培养48 h IL-6的分泌动力学：原代培养的人胚胎胰岛每4 h收一次上清，共收48次。图1所示，原代培养的人胚胎胰岛细胞IL-6的分泌在40 h内呈上升趋势，从4 h开始即可测出上清中含有IL-6、40 h达高峰，44 h开始下降。胰岛素的分泌分别在培养8、20、32、44 h，即每12 h出现1个分泌高峰，胰高血糖素的分泌在培养36 h内呈上升趋势，40 h开始下降。
Fig 1 Secretion of IL-6, insulin, glucagon in supernatant of islets cultured for 40 h
图1 人胚胎胰岛体外培养48 h IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况
2.人胚胎胰岛体外培养每24 h一个周期IL-6的分泌动力学：原代培养的人胚胎胰岛接种到24孔培养板，每24 h收获全部上清，换取新鲜培养液，共收获13次。如图2所示，IL-6的含量以第一个24 h最高，以后随培养时间延长逐渐下降，在培养第5个分泌周期又出现1个小的分泌高峰。胰岛素分泌以第一个24 h最高，以后随培养时间延长，含量逐渐下降。胰高血糖素分泌在第1～8个分泌周期波动不大，在第8～9周期分泌升高，细胞成活率均在95%以上。
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