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利用GFP示踪细胞内源性P53活性检测DNA损伤 |
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DNA损伤是基因突变的前奏，是癌变、畸变的分子基础。许多理化诱变因素大都是先使细胞DNA受损，进而诱发基因突变的〔1, 2〕。 然而，DNA损伤的检测至今尚无完善的检测方法和统一的标准。现有的几种检测方法，如: 碱性解旋法，单个细胞凝胶电泳（SCGE）等方法灵敏度都较低，只能检测较严重的DNA损伤，而且不易量化〔3〕。小的DNA损伤或点突变虽可能不引起细胞死亡，但有累积效应和遗传性，会增加生物的遗传负荷，对人类和其他生物形成远期危害。故有必要建立更为灵敏的检测方法。
通过检测DNA损伤应激基因（Stress gene）GADD45、p53等的活性，间接地评判DNA损伤是近年来发展起来的新方法。p53在正常的生理状态下几乎没有活性，当DNA受损时活性升高，使细胞停滞在G1期，利于受损DNA修复。而当DNA的损伤不可逆时，则启动细胞程序性死亡（PCD）〔4～7〕。P53是一种核内转录调控蛋白，通过反式转录激活方式调控相关基因的转录。P53羧基端能与特异的DNA序列（P53 respose element P53RE）结合，而P53氨基端则有较强的激活转录功能，可激活P53RE下游基因的转录〔6～8〕。Todd等〔9〕用氯霉素酰基转移酶（CAT）反映细胞内源性P53活性来检测DNA损伤，结果灵敏稳定。但CAT的检测要用放射性同位素，不够安全，而且费用较高，限制了其推广应用。
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein GFP）是来源于水母的荧光蛋白，在紫外和蓝光激发后发绿色荧光，作为报告基因已广泛应用于原核和真核细胞，示踪外源基因表达〔10～13〕。GFP是目前唯一能在活体细胞中观察的报告基因。它对细胞无毒性，经乙醇或甲醛等固定后很稳定，荧光不易“淬灭”，可以较长时间保存〔13〕。我们构建P53RE与GFP融合基因真核表达载体，转化NIH 3T3细胞，以GFP示踪内源性P53活性来检测DNA损伤。用紫外线和H2O2处理转化细胞使DNA损伤，诱导P53表达，通过观测GFP的荧光强度变化验证此方法检测DNA损伤的特异性和效率。现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 材料
质粒pGL2-control（Promega）含有SV40基本启动子和luc基因。Alpha+GFP-C3（Maxygene）含有GFP基因和真核强启动子Alpha。NIH 3T3细胞株为我室保存。内切酶、工具酶：SmaI、Bgl Ⅱ、KpnⅠ（Bio Lab），Bsp120Ⅰ（ApaⅠ）、XbaⅠ（MBI），Taq酶、dNTP（Sangon），Klenow Fragment、T4 ligase（Promega）。Lipfectin, DMEM（Life Tech），G418 (Sigma), 胎牛血清（四季青公司）。引物和P53RE由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。上游引物SP1: 5 AGG GGC CCT GTA ACT GAC TAA C3 ； 下游引物SP2: 5 GCT CTA GAG TAC CGG AAT GCC A3 , 扩增PGL2-control质粒上多克隆位点和SV40启动子序列，在上下游引物中分别设计有Bsp120Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。P53RE的设计参照Kern SE等〔6〕的方案。
RE1: 5 GAT CCT GCC TGG ACT TGC CTG3
RE2: 3 GA CGG ACC TGA ACG GAC CTA G5
仪器：PTC-100热循环仪（MJ ResearchInc），AH2-RFL研究用显微镜（Olympus)，激光扫描共聚焦图象分析系统（LSCIS）MRC-1024（Bio-Rad）。
1.2 载体构建
载体构建方案如图1所示。切除Alpha+GFP质粒Alpha启动子, 接上来源于pGL2质粒的SV40基本启动子，构建成对照质粒pSV-GFP。在pSV-GFP质粒SV40启动子上游插入P53RE构建成示踪质粒p53RE-GFP。
1.3 细胞转染
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