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水稻抗白叶枯病基因Xa |
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福等（1996）用PCR技术诊断Xa-21基因〔5〕。1997年，Huang等用分子标记辅助选择建立了Xa-4、xa-5、xa-13及Xa-21四个抗白叶枯病基因的累加系；而且用分别与xa-5、xa-13紧密连锁的RFLP标记设计引物，建立了这两个基因的特异性扩增多态性（SAP）标记体系，从而提供了一种快速、简便的分子标记辅助选择手段。但当他们以与Xa-4相距1.7 cM的分子标记〔6〕设计引物，试图建立Xa-4基因的PCR标记体系时，却没有成功〔7〕。最近，我们根据M55两端的序列设计引物，通过PCR进行特异扩增，初步建立了Xa-4的PCR标记体系，并对一些三系杂交水稻材料进行了检测。
1 材料与方法
1.1 植物材料
水稻抗白叶枯病近等基因系和基因累加系由国际水稻所提供(郑康乐研究员转赠)。表1中，5～10、12各含一个抗白叶枯病基因，与IR24为近等基因系；13～22为2～4个基因的累加系；IR20和IR64为含Xa-4基因的纯系。CBB4是中国农科院作物所章琦实验室提供的沈农1033的近等基因系，含Xa-4基因〔8〕。表2中的49份杂交水稻材料由四川省农科院水稻高粱研究所及四川农业大学水稻研究所提供。
1.2 半粒种子提取液的获得
将整粒种子对等切成两部分，参照Chunwongse〔9〕方法，胚乳部分放入1.5 ml离心管，加入150μl PCR缓冲液，其中含10 mmol/L Tris.HCl pH9.0, 50 mmol/L KCl, 1.8 mmol/L MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.45% NP-40, 0.45% Tween-20和40μg蛋白酶K。50℃至55℃保温1 h，14 000 rpm 2 min，100℃加热5 min，14 000 rpm 2min, 上清液可用于PCR分析，带有完整胚的半粒种子用于发芽。
1.3 叶片DNA的提取
剪取新鲜叶片，按文献所述提取DNA〔10〕。
1.4 PCR分析
根据分子标记M55设计的引物序列为：MP1 5 -ATCGATCGATCTTCACGAGG-3 ，MP2 5 -dTGCTATAAAAGGCATTCGGG-3 。PCR反应按下列条件进行：取1μl叶片DNA溶液（50～100 ng/μl）或30μl半粒种子提取液，在总体积为50μl的体系中进行PCR反应。其中含10 mmol/L Tris.HCl pH9.0, 50 mmol/L KCl, 1.8 mmol/L MgCl2, 0.1% Triton X-100, 每种dNTP 200μmol/L, 每一引物50 pmol，Taq酶2单位。PCR反应在Perkin Elmer Cetus 480型DNA扩增仪上进行，反应条件为94℃变性5 min, 再以94℃ 1min, 55℃ 1 min, 72℃ 2 min进行35个循环，最后于72℃保温10 min。
扩增产物用3％琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中稳压100伏电泳4小时左右，紫外灯下观察照相。
2 结果与讨论
2.1 Xa-4基因PCR检测系统的建立
用设计的引物MP1和MP2对IR24及其含Xa-4的近等基因系IRBB4进行特异PCR扩增时，发现二者间的扩增带型不同。其中IRBB4的特异扩增产物为160 bp，而IR24的为140 bp。遂对表1中这些已知抗性基因构成的材料进行特异扩增分析，首先用叶片DNA作模板，结果见图1。如图所示，凡含抗病基因Xa-4的纯系，都一致地产生160 bp的特异扩增带；反之，则产生140 bp的特异扩增带；而杂种F1同时产生这两条带。由于Xa-4为显性抗病基因，我们将其纯系的扩增带型记为11，感病隐性等位基因纯系的扩增带型记为22，杂合体记为12。因此，该PCR标记可以清楚地揭示Xa-4基因位点的基因型。
我国育成的抗白叶枯病品种长期使用的是单一的Xa-4基因，导致新育成品种对病原菌的抗性下降。有效的策略是通过抗性基因的累加，培育含多个抗病基因的累加系〔11〕。Yoshimura通过Xa-4/ xa-5，xa-5/Xa-10的累加发现抗病基因累加系的抗性强于亲本的抗性之和〔12〕。国内的研究也说明了抗性基因间的相互作用有利于抗性的提高〔11, 13〕。然而，在基因的累加过程中，由于基因上位作用及掩蔽效应，如Xa-21抗所有BB小种，就可能掩蔽Xa-4和其它基因的抗性表现，使传统的育种选择方法显得无能为力。通过分子标上一页 [1] [2] [3] 下一页
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