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中国及荷兰人群vWF基因内含子40多态性分析 |
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10pmol 引物，1 u Taq DNA多聚酶。PCR在FR-300扩增仪(复华实业公司)中进行。扩增条件如下：94℃1分钟，54℃1分钟，71℃1分钟，35个循环后71℃保持5分钟。
1.2 扩增产物分析
PRC扩增片段的分析采用非连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色法。凝胶体积为95×65×0.5mm，其中分离胶长75mm，成层胶长20mm。成层胶胶浓度为5.0%，交联度为2.6%，凝胶缓冲液为0.4mol/L 2-二羟乙基亚胺-三羟甲基甲烷(Bistris), 0.1 mol/L H2SO4，8%甘油，pH 6.7。分离胶胶浓度为8%，交联度为5%，以Tris 0.4mol/L, H2SO40.1mol/L作为缓冲系统，8%甘油，pH8.6。负极电极液为0.4mol/L N、 N-2(乙基)甘氨酸(Bicine), 0.2mol/L NaOH, pH8.2。正极电极液为0.4mol/L Tris, 0.1mol/L H2SO4, pH8.1。用高密度海绵汲取正负电极缓冲液，以等电聚集电泳电极接触海绵通电。
电泳及染色条件：样品同载样液以1：1稀释，(载样液：溴酚蓝溶于双蒸水中，终 浓度为0.025%)。电泳条件：两极间距：9.5cm。最大电流及电压分别为25mA和350V，电泳时间45～60分钟，电泳温度为10℃。银染色条件如下：20%三氯醋酸，20℃5分钟，5%戊二醛20℃ 10分钟，20℃水洗 两次各5分钟，0.4%硝酸银20℃，18分钟，20℃水洗两次各5分钟，于0.014%福尔马林、5%碳酸钠溶液中显色15分钟，最后在20℃醋酸中停显8分钟。
经测序确定TCTA数目的不同等位基因片段作为等位基因梯度标准，用以作为待测DNA片段大小判定依据(图1)。
图1 人类HUMFA 31 (C)分型图
图1表示人类vWF基因内含子40(nt 31/2 215～2 380)分型电泳图；等位基因梯度标准经序列测定已确定了其重复子数目。
1.3 序列分析
在杂合子个体PCR产物中找出等位基因片段长度相差8bp以上的样品9个，PCR产物于2%的低熔点琼脂糖电泳，切割待测谱带，测序。测序试剂盒来自GIBCO BRL Technologies Inc.。
1.4 统计学处理
中国及荷兰群体资料的遗传平衡检验采用标准卡方检验及拟然比检验〔5, 6, 7〕，若标准卡方检验期望值不足5时需合并计算并相应改变自由度。杂合度无偏期望值的估算法及多态信息含量(PIC)的计算见参考文献〔8, 9〕。
2 结果与讨论
人类vWF基因内含子40(nt 31/2 215～2 380)基因频率及基因型频率在荷兰莱顿群体中的分布见表1, 在中国太原群体中的分布见表2。
表1 人类vWF基因内含子40(nt 31/2 215～2 380)基因频率及基因型频率在荷兰莱顿群体中的分布(n=114)
等位基因 11)(174bp)2) 2(170bp) 3(166bp) 4(162bp) 5(158bp) 6(154bp)
1(174bp) 13)(0.49)4) 3(1.24) 3(3.76) 5(5.98) 1(1.42) 1(1.48)
2(170bp) 2(0.79) 3(4.81) 5(7.57) 3(1.82) 1(1.89)
3(166bp) 9(7.37) 23(23.13) 6(5.56) 5(5.79)
4(162bp) 22(18.15) 6(8.73) 8(9.09)
5(158bp) 2(1.05) 2(2.19)
6(154bp) 3(1.14)
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