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磷酸化酶mRNA在水稻雌蕊中表达的时空动态 |
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春江5号开花前后的雌蕊, 用FAA(10%甲醛, 50%乙醇, 3%冰乙酸)固定, 经叔丁醇系列脱水后, 石蜡切片, 厚度为8～10μm。
磷酸化酶cDNA由Sasaki等〔4〕分离, 日本水稻基因组研究计划Nagamura博士提供, 长度为0.85kb, 克隆在pBluescriptⅡSK+质粒中, 克隆位点NotⅠ/SalⅠ, 两端分别有T3和T7 RNA多聚酶启动子。按Sarmbrook等〔5〕的方法转化、扩增和提取质粒, 受体菌株为TG1。
1.2 RNA原位杂交
按我们前文〔6〕的方法进行。质粒用SalⅠ或 NotⅠ内切酶线性化后, 前者用T3、后者用T7 RNA多聚酶分别体外转录DIG标记的反义RNA和有义RNA(对照)。切片经预杂交处理后, 用反义RNA和有义RNA分别作原位杂交。经洗涤, 再用带有碱性磷酸化酶的抗DIG抗体(anti-DIG-AP)作免疫反应, 用氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)显色, 封片观察。有蓝紫色沉淀产生的为阳性反应。
2 结果与讨论
用磷酸化酶反义RNA为探针对水稻受精前后的雌蕊进行原位杂交, 不同组织中有蓝紫色沉淀的阳性反应产生, 并表现出明显的时空分布差异。用有义RNA为探针进行的原位杂交, 则除适量的背景外无阳性反应(图版Ⅱ, g)。
2.1 柱头和花柱磷酸化酶mRNA表达特征
水稻雌蕊柱头和花柱在受粉前后都有很强的磷酸化酶mRNA表达, 主要分布在柱头毛、花柱表皮和花柱中央的维管束内, 尤其是柱头毛细胞内mRNA表达强度非常显著(图版Ⅰ, a)。花粉粒在柱头上萌发, 不仅柱头细胞内而且花粉粒及伸进柱头的花粉管中也有明显的阳性反应(图版Ⅰ, b)。花柱维管束中的表达也很明显(图版Ⅰ, c)。
雌蕊柱头及花粉管生长途径的分泌物质富含游离糖, 多糖, 糖脂和糖蛋白。糖蛋白在提供花粉管营养和粘附支持、定向引导以及花粉与雌蕊的识别等方面起重要作用〔7〕。磷酸化酶不仅能将Glcn降解成小分子游离糖给植物细胞提供营养, 而且在糖蛋白合成中起催化作用〔1〕。本文观察到磷酸化酶mRNA在柱头表面和花柱维管束中的显著表达, 可能不仅与Glcn的降解、利用有关, 还在吸引和促进花粉管生长的糖蛋白的合成方面起着一定的作用。柱头毛细胞和花粉内的磷酸化酶表达, 催化糖蛋白的合成, 可能在花粉与柱头的相互识别和花粉萌发中起重要作用。
2.2 子房磷酸化酶mRNA表达特征
磷酸化酶基因在子房内的表达呈明显的空间分布差异。受精前后的子房壁都有大量的磷酸化酶mRNA分布, 外表皮及以内数层薄壁细胞表达最强, 向内逐渐减弱。胚珠内的表达很弱, 仅内外珠被有较明显的蓝紫色沉淀(图版Ⅰ, d)。值得一提的是, 在胚珠与子房壁相连的合点部位有较强的磷酸化酶mRNA表达(图版Ⅰ, e)。在子房壁与子房基部维管束的薄壁组织中也有很强的表达(图版Ⅰ, f)。受精前后的反足细胞、卵器、合子和中央细胞中磷酸化酶mRNA表达很弱, 并没有明显的时空变化(图版Ⅱ, a、c)。
根据生理功能和发育阶段的不同, 植物组织内淀粉的积累有储藏性和过渡性两种类型〔8〕。水稻雌蕊在受精前后大量调集糖类物质供生长发育利用，没有及时利用的单糖或寡糖合成过渡性淀粉而暂时储存。子房壁、维管束及胚珠合点中磷酸化酶mRNA的大量表达可能与糖的合成、降解和转运有关〔3〕。磷酸化酶基因的表达受糖含量变化的调控, 糖调节基因表达不仅与细胞对糖转运的反应一致, 而且协调植物各器官组织对糖源的利用和 分配〔9〕。胚珠内所利用的糖类物质是以寡糖或单糖的形式通过合点端从子房壁输入的。处于发育盛期的胚珠, 迅速将寡糖分解、转化利用, 没有过量糖的积累来合成过渡性或储藏性淀粉。因此, 依赖高含量糖刺激才能表达磷酸化酶基因在胚珠与胚囊的几乎所有细胞中的表达均很弱。
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