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微量全血培养在HIV感染诊断中的应用 |
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下。
1 研究对象及方法
1.1 研究对象 经本室确认的4例HIV抗体阳性者，男女各2名，年龄在23～60岁。根据我国HIV/AIDS诊断标准（国家标准1995），其中1例为艾滋病病人，其余3例为无症状HIV感染者。
1.2 标本采集 无菌操作抽取静脉血15 ml，注入含肝素抗凝剂的无菌试管中（其肝素钠含量为10～20 IU/ml）。血样在取血6 h内进行共培养。
1.3 正常人淋巴细胞（PBMC）的制备 按常规抽取正常人（艾滋病抗体检测阴性，无其它传染病者）静脉血，肝素抗凝，1000 r/min离心，吸出血浆，血细胞用Hanks液稀释至原体积的3倍，用Ficoll-Hypaque液分离并收集PBMC，Hanks液洗2次，然后悬浮在RPMI 1640刺激培养基中（其中每毫升培养液中含有10%热灭活胎牛血清、青霉素100 IU、链霉素100 μg、IL-2 100 IU、谷氨酰胺2 mmol、PHA-P 5 μg 及Polybrene 5 μg），调整细胞数为2×106/ml。在5%CO2、37℃温箱中培养48～72 h，即为活化的PBMC，或与病人全血进行同时刺激共培养。
1.4 常规共培养 用上述方法分离出病人的PBMC，1×107感染者PBMC与5×106活化了的健康供者PBMC共同培养在15 ml的淋巴细胞生长液中（其中每毫升生长液中含有10%热灭活胎牛血清、青霉素100 IU、链霉素100 μg、IL-2 100单位、谷氨酰胺2 mmol、神经氨酸酶0.003 IU及Polybrene 5 μg），每隔3～4 d换液1次。其中在第7、14及21天还需补充5×106活化的供者PBMC，共培养28 d。每次所移去的上清液均须保存，以便检测P24抗原。
1.5 微量全血培养
方法1： 将含有肝素抗凝剂的受检者全血以终点稀释在24孔板上（每孔量分别为1000， 500， 250， 125， 62.5，10 μl），加入激活了的正常人的PBMC 106进行复孔培养，每孔加入淋巴细胞生长液，使总量为2 ml，置5%CO2、37℃温箱中培养。
方法2： 将含有肝素抗凝剂的受检者全血以终点稀释在24孔板上（每孔量分别为1000，500，250，125，62.5，10 μl），加入新鲜的未经PHA-P激活的正常人PBMC 1×106进行复孔培养，每孔加入RPMI-1640刺激培养基，使总量为2 ml。刺激培养3 d后，复孔中1孔收集离心，弃上清，沉淀物用淋巴细胞生长液悬浮，培养在另一24孔板中（即其中不含PHA-P），另1孔不收集离心，按常规用淋巴细胞生长液换液（即其中含有少量的PHA-P）。
以上两种方法的全血培养每隔3～4 d移去1 ml培养上清液，随之补充1 ml新鲜的生长液，其中在第7、14、21天还需补充106新鲜的激活了的正常人PBMC，共培养28 d。每次所移去的培养液均须保留以便检测其P24抗原的含量。
1.6 P24抗原检测及结果判断 P24抗原试剂盒为Organon Teknika公司生产的Vironostika HIV-1 Antigen Microelisa System试剂盒，批号99101806；酶标仪Bio-Rad 550型。操作步骤严格按说明书进行。每3 d进行一次P24抗原检测。
阳性结果判断：在整个培养过程中首次出现阳性的样本，其P24抗原值必须大于30 pg/ml，若紧接着的下一个取样标本也是阳性而且其P24抗原值比前一个样本值高4倍以上，则可以肯定受检者的血液标本为艾滋病病毒阳性。培养过程中，连续两次取样（即间隔3～4 d）均呈现P24抗原阳性，且OD值大于3.0，即可终止培养。若培养的全过程至第28天均为阴性，则在第28天或32天终止培养。
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