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2株分离的嗜人T细胞白血病病毒I型的PCR检测 |
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勒比海及南美安第斯山脉地区。大洋洲的巴布亚新几内亚和澳大利亚的美拉尼西亚人中HTLV-I的感染率较高。欧洲仅有意大利、葡萄牙等少数几个国家存在HTLV-I的感染［4］。1984年曾毅等对全国28个省市进行了HTLV-I感染的血清流行病学调查，HTLV-I抗体阳性率为0.08 %，阳性者均为日本人或与日本人有密切关系者［5］。1989年吕联煌等在福建省沿海发现了HTLV-I的小流行区，在健康人群中其抗体阳性率为1.2%［6］。后来在国内陆续有些新的病例及携带者被发现。
据研究，HTLV-I病毒基因组的5′端至3′端由依次排列的gag、pol、env、和px等基因组成，其两端各有一个长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR)。Gag是主要结构蛋白的基因、编码病毒的衣壳蛋白；Pol是编码病毒的逆转录酶、蛋白水解酶、RNA酶H和核酸内切酶；Env是编码病毒的包膜糖蛋白，与宿主细胞表面的特异性CD4+ 受体结合并诱导机体产生相应的抗体；Px含有3个调节基因，其中tax基因以反式作用于病毒LTR 上的转录起始区，启动病毒复制，同时也转活化一些细胞基因的转录，如IL-2、IL-2R、GM-csf、C-sis及C-fos等。这些基因均与T细胞增殖相关。HTLV-I所致的T淋巴细胞白血病是一个多阶段的演发过程。病毒首先感染、侵入有CD4受体表达的T细胞，继而病毒的基因组以前病毒DNA的形式整合于宿主染色体DNA上。在病毒复制过程中，通过病毒tax基因产物的作用，使感染病毒的T细胞大量扩增。由于HTLV-I前病毒DNA可以整合于CD4+ 细胞染色体DNA中的随意位置，产生多克隆扩增，当这些细胞继续增殖时，某个克隆中个别细胞的染色体如果发生变化，这个细胞就会转化为白血病细胞，最后因其不断增殖成为T细胞白血病的细胞克隆。
聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）已广泛应用于诊断包括HTLV-I在内的病毒感染。本文即用PCR法检测体外培养中HTLV-I前病毒的存在。现将在日本所作的研究工作报告如下，以便为今后在国内开展HTLV-I携带者的调查诊断与进一步研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 通过肝素抗凝采集日本鹿儿岛县2例ATL患者外周血，用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞（Periferal blood mononuclear cell，PBMC）与健康人PBMCs共同培养，同时加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）和白介素-2（IL-2）。PBMCs冷藏于液氮中。
1.2 试剂 Ficoll-Paque购自瑞典Uppsala的Pharmacia公司。PHA由Difcor实验室提供。rIL-2购自日本大阪的武田化学工业公司。DNA抽提试剂盒（碘化钠法）及Marker 5(ΦX174/Hinc II digest)购自日本大阪和光纯药工业株式会社。PCR反应体系10xPCR buffer，dNTP，Taq DNA polymerase购自美国新泽西的铂金*埃尔默公司。
1.3 细胞 MT-2细胞株能持续不断地产生HTLV-I病毒粒子，由Kochi Medical School 的I. Miyoshi博士慷慨提供。CEM细胞株为成淋巴细胞白血病细胞株，不含HTLV-I病毒粒子。
1.4 DNA抽提 应用碘化钠法，按照说明书进行。步骤大致如下：用200 μl PBS(-)悬浮3～7×105个细胞，加入10 μl十二烷基肌氧酸钠及碘化钠混合糖原溶液，40℃水浴15 min，然后加入450 μl异丙醇，室温放置15 min，10000 r/min，4℃离心15 min，弃上清，加入100%乙醇500 μl ，10000 r/min，4℃离心15 min，弃上清，加入70%乙醇800 μl，10000 r/min，4℃离心15 min，弃上清，进行2次后，放入离心干躁机中6 min。之后用100 μl ddH2O（灭菌双蒸水）重新悬浮DNA，将DNA稀释1/10后于UV/VIS分光光度计测DNA溶度。抽提的DNA置-20℃贮存。
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