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四川省HIV |
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ubtype C strain of sc3 is special and its source remains notclear.
Key words HIV-1 Subtype Gene variation
从1995年开始，在四川若干地区的人群及凉山州注射吸毒人群中先后发现了一定数量的HIV-1阳性感染者。从初步的流行病学调查结果看，凉山州静脉吸毒人群中HIV-1的传入可能与在云南德宏州吸毒人群中流行的HIV-1毒株有关，而在其它地区出现的HIV-1的流行情况则较为复杂。为了对流行于四川境内的HIV-1毒株有一较全面的了解，我们于1996年6月采集了一批HIV阳性感染者血样，对HIV-1毒株env基因C2-V3区序列进行了测定和分析。
材料和方法
一、对象和样品：研究对象为9名四川省HIV-1抗体阳性的经血途径感染者，其中3人为注射吸毒人群，其余6人有频繁外出流动及职业献血史。每名对象采集静脉血3～5ml，肝素抗凝(20U/ml)，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，用常规方法提取染色体DNA。
二、PCR：按nested-PCR方法，设计合成多对PCR引物〔9〕，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧扩增引物，按常规方法进行第一次PCR反应，取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，进行第二次扩增得到env基因C2-V3区，用Qiaegen公司的Qiaex试剂回收并纯化以上扩增产物。
三、核苷酸序列测定：分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
四、序列分析：测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括：①用piluep程序对样品及国际标准序列的排列和比较；②用pretty程序计算一组序列的共享序列(consensus sequence)；③用distances计算一组序列间的基因离散率；④用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)分析。
结 果
经nest-PCR扩增后，从9份HIV-1阳性者PBMC样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段。将由env-D3和env-f2引物测序结果进行编辑整理后，根据序列特征，9个毒株可分为两组，第一组5个毒株，均来自职业献血员，第二组4个毒株，包括3例吸毒者和1例职业献血员。
将两组毒株核苷酸序列分别与国际A～E 5个亚型的共享序列(A con～E con)及B和C亚型部分代表株核苷酸序列进行比较，计算彼此间的基因离散率(附表)，结果发现第一组5个毒株与A、B、D和E亚型共享序列间的离散率均在23%以上，与主要代表欧美B亚型的B con间仅为7.9%，而与属泰国B亚型的毒株包括泰国t8655、缅甸mnrp05和云南yn289间的离散率分别为4.3%、3.6%和4.1%。第二组除sc3外的其它3个毒株与主要代表印度C亚型的C con和云南C亚型代表株yn272间的离散率均为3.1%，与非洲C亚型代表株nof的较大，为13.1%，而与其它亚型的差异最大均在22%以上；sc3号样品序列则较为独特，与组内其它毒株、C con、yn272和nof间的差异分别为11.5%、10.1%、11.6%及17.2%，与其它几种国际亚型间的差异更大，均在24%以上。
进一步的系统树分析也显示，第一组5个毒株与B con及t8655、mnrp05和yn289等聚集在一起而远离其它国际亚型毒株序列，第二组除sc3外的3个毒株与C con和yn272聚集在一块，与nof稍远但远离其它国际亚型毒株(附图)。尽管sc3与上述代表序列间均有一定的距离，但由于其距其它亚型更远，因而仍属C亚型毒株。比较四川两亚型毒株组内的基因离散率可以看出B亚型毒株(1.4%)较C亚型(sc3除外，2.6%)为小。
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