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细胞因子对小鼠 2 I 型前胶原基因启动子活性影响的研究 |
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活有关［1，2］。早期的研究已证实肝纤维化形成时肝脏贮脂细胞合成的I型胶原mRNA水平显著上升［3］。尽管目前纤维化疾病中胶原基因表达激活机理仍不清楚，但胶原基因的激活常与炎症损伤相伴出现，提示细胞因子与胶原基因激活有关［4，5］。目前较明确的多肽类生长因子TGFβ能显著激活前胶原基因［6，7］，而淋巴因子TNFα、IFNγ有一定的抗纤维化活性［8，9］。本研究应用小鼠α2(I)前胶原基因启动子(-2 kb～+54 bp)与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成的重组体及基因转染技术，探讨IFNα、IFNγ、TNFα对小鼠α2(I)前胶原基因上游启动子活性的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 小鼠NIH／3T3细胞以含10%FCS的1640(Gibco)培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。
1.2 重组体质粒的制备 含小鼠α2(I)前胶原基因启动子-2 kb～+54 bp及报告基因的重组体质粒pZA1009美国NIC Crombrugghe教授惠赠［10］(见图1)，经转染至大肠杆菌并筛选，酶切鉴定正确后，Qiagen plasmid midi kit大量扩增抽提、纯化质粒，紫外分光光度计(Du-600, Beckman)测得率、纯度，-20℃保存待用。作内对照用的碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck & Co.InC.惠赠)及阳性对照含CAT的表达质粒pSV2CAT(Invitrogen)亦经同上方法扩增，抽提纯化后-20℃保存待用［11］。
图1 含小鼠α 2(I)型前胶原基因-2 kb～+54 bp片段(黑色部分)及CAT报告基因的质粒pAZ1009
Fig.1 Plasmid PAZ 1009 contains-2 kb～+54 bp fragment of mouse α2(I) procollagen gene (black part) and CAT as reporter gene
1.3 DNA转染及细胞因子处理 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim)：NIH／3T3细胞以5×105／孔接种于6孔培养板(Nunc)，细胞贴壁后分别用rhTNFα(第二军医大学)100 U／ml、 rhIFNα(Roche)1 000 U／ml+rhTNFα 100 U／ml、rhIFNγ人或鼠(第二军医大学)1 000 U／ml+rhTNFα 100 U／ml处理24 h换新鲜但不含FCS的培养基，质粒DNA以脂质体／DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck&Co.InC.惠赠)作内对照及含CAT的表达质粒(Invitrogen)作阳性对照。转染后6 h，每孔细胞加两倍于正常量的FCS(20%)，24 h后换新鲜含10%FCS的培养基，并加转染前相同种类、数量的细胞因子，继续培养24 h后，测报告基因CAT活性。
1.4 CAT及碱性磷酸酶(AP)活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、AP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
2 结果
胶原产生细胞NIH／3T3细胞经细胞因子预处理和转染后再处理24 h，ELISA测定细胞裂解液中CAT表达量，同时测定蛋白浓度及AP活性，AP表达活性作为内对照以保持转染效率，相同条件下比较CAT表达量。CAT测定结果用相应蛋白含量及AP活性校正后与未经细胞因子处理的细胞裂解液CAT的相对比值见图2，即TNFα 100 U／ml，IFNα 1 000 U／ml+TNFα 100 U／ml，IFNγ 1 000 U／ml+TNFα 100 U／ml预处理24 h及后处理24 h的细胞CAT表达活性下降，亦即上述细胞因子下调小鼠α2(I)型前胶原基因启动活性。
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