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柯萨基B3病毒感染增强单个核细胞与心脏微血管内皮细胞的粘附 |
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单个核细胞向心肌组织浸润，继而引发的一系列免疫反应是造成心肌细胞损伤的重要因素。循环中的单个核细胞通过膜表面粘附分子及各种细胞因子的介导，与心脏微血管内皮细胞粘附是向心肌移行的关键步骤。柯萨基B3病毒(Coxsackie B3 virus, Cox B3)是一种嗜心病毒，对心脏血管内皮细胞有很高的感染性［1］。病毒可以通过病毒血症或受染白细胞的游走，感染心脏血管内皮细胞，受染内皮细胞表面粘附分子的表达有何改变?对白细胞的粘附效应有无影响?均未见报道。本研究观察了Cox B3感染诱导内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，及对粘附效应的影响。
1 材料与方法
1.1 病毒 Cox B3(Nancy)引自昆明医学生物研究所，在Wish细胞上增殖并滴定感染性(LgTCID50／ml)。
1.2 单克隆抗体 分泌抗大鼠LFA-1(CD11α)和抗大鼠ICAM-1(CD54)单克隆抗体杂交瘤细胞株WT-1和1A29由日本Miyasaka教授惠赠，常规培养并接种Balb／c鼠诱生腹水。单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法［2］部分纯化，活性按文献报道方法进行测定［3］。
1.3 心脏微血管内皮细胞的制备和病毒感染 参照Nishida等［4］的方法，取5～7 d SD大鼠心脏，用Hank′s液洗尽血液，去除瓣膜、大血管等，剪开心室将心脏浸入75%乙醇30 s以灭活心外膜和心内膜内皮细胞。剪碎心肌组织，用0.2%胶原酶(Ⅱ型，Sigma)和0.1%胰蛋白酶(Difco)37℃水浴消化20 min，细胞过200目筛网，悬于10%小牛血清RPMI1640培养基。接种于0.2%、明胶(Sigma)预处理的培养皿培养4 h，去除未粘附细胞，更换含50 mg/L肝素(Sigma)、10 mg/L内皮细胞生长因子(Boehringer)的RPMI1640完全培养基。3～4 d换液1次，直至长成细胞单层，实验选用3～4代的内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。选择100、400 TCID50／ml Cox B3感染内皮细胞，病毒吸附2 h。细胞洗涤后继续培养24、48 h。
1.4 单个核细胞的制备和激活 大鼠乙醚麻醉，无菌取下腔静脉抗凝血，常规用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。洗涤2次后，用10%小牛血清RPMI1640培养基培养，并加入终浓度为5 μg/ml的Con A(Sigma)活化淋巴细胞。取活化48～72 h的淋巴细胞备用。
1.5 单个核细胞与内皮细胞的粘附试验及单克隆抗体的阻断效应 弃去内皮细胞的培养基，用Hank′s液洗1次。将激活淋巴细胞调整浓度至5×105 ml-1，加入内皮细胞培养板中，每孔0.1 ml。置37℃5%CO2培养箱粘附2 h。轻震培养板后弃尽孔内液体，用预温生理盐水洗2次，洗去未粘附细胞。每孔加入2%刚果红0.1 ml，室温染色20 min。弃染液，用生理盐水轻洗2次。0.01 mol／L PBS-乙醇液脱色，自动酶联仪测定λA570 nm，参考波长λ690 nm。设单个核细胞与500 U TNFα诱导内皮细胞、未感染内皮细胞粘附为阳性和阴性对照。设单纯内皮细胞和单个核细胞孔、同剂量病毒感染内皮细胞孔为对照。
将抗LFA-1和ICAM-1单抗20 μg/ml分别加入粘附实验孔中，共同孵育，余步骤同上。以同浓度小鼠抗甲状腺球蛋白单克隆抗体为对照。
1.6 流式细胞仪分析 将Cox B3感染24、48 h的内皮细胞用0.25%胰蛋白酶消化分散，生理盐水洗3次。加入20 μg/ml抗ICAM-1单抗，4℃作用40 min。洗涤3次后，加入1∶100 FITC-抗鼠IgG(购自华美生物试剂公司)，4℃作用40 min。洗涤后用0.2%多聚甲醛固定20 min，悬于PBS液中。用流式细胞仪(Becton Dickinson)分析内皮细胞ICAM-1的表达情况。
1.7 数据处理 采用Student“t”检验。
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