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竞争性化学发光酶免疫分析法检测睾酮 |
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性机能减退。在女性，血清睾酮的异常增高常提示肿瘤的可能性。另外，血清睾酮浓度的监测还有助于了解男性青春期发育的情况。近年来国内外建立了多种非放射免疫分析法检测睾酮［1］，但使用鲁米诺增敏化学发光体系的方法尚未见报道。本文研究了三种不同的方法，建立了直接的化学发光酶免疫分析法检测血清睾酮。
1 材料与方法
1.1 试剂 睾酮、睾酮-C3-羧甲基肟、丹那唑、辣根过氧化物酶(HRP)、山羊抗鼠抗体(GAM)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠体(GAM-HRP)均购自Sigma公司。抗睾酮单克隆抗体购自美国Indyhill公司。ProClin 300购自美国Supelco公司。
1.2 增敏化学发光液的配制 参见文献［2］。
1.3 去类固醇血清的制备 将10 g活性碳加到100 ml正常人血清中，室温16 h间断震荡，悬液4℃54 000×g离心2 h，用放射免疫分析法检测，不能测出睾酮。
1.4 标准品的配制 用无水乙醇将睾酮配制成一定浓度，然后加入去类固醇激素血清中，稀释成终浓度分别为0.0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/ml，作为标准品。
1.5 缓冲液的配制 包被缓冲液：0.05 mol/LpH 9.6 碳酸缓冲液。封闭液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入1%脱脂奶粉。洗涤液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入0.05%吐温-20。分析缓冲液：在0.01 mol/L pH 7.0 PBS中加入牛血清白蛋白10 mg/ml，丹那唑1 mg/L。各溶液中加入ProClin 300(1∶2 000)防腐。
1.6 睾酮的酶联标记［3］ 根据文献加以改进。睾酮-C3-羧甲基肟2.6 mg溶于450 μl蒸馏的二氧六环中，后者含有50 μl三正丁胺溶液(用二氧六环 3∶100 稀释)，然后加入50 μl氯甲酸异丁酯溶液(用二氧六环3∶200稀释)，混合物10℃搅拌30 min，然后加入到HRP溶液中(2 mg/3.5 ml，10%二氧六环稀释，用NaOH将pH调到9.0，温度4℃)，搅拌5 min，pH调至8.5，4℃置4 h，透析48 h直到无游离的睾酮-C3-羧甲基肟，加ProClin 300(1∶2 000)。
1.7 睾酮-BSA的制备 同1.6，用紫外分光光度计和放免法计算睾酮与牛血清白蛋白分子数之比为10∶1。
1.8 睾酮检测方法 方法1：将睾酮抗体用包被缓冲液稀释，加到96孔板中，每孔100 μl，4℃过夜，次日用封闭缓冲液每孔200 μl，封闭30 min，洗涤3次，加入标准血清20 μl，睾酮-HRP 100 μl(1∶10 000)，室温孵育60 min后，洗涤3次，每孔加入200 μl发光液，5～20 min检测，检测时间为1 s，检测仪器为EG&G Berthold 96P(德国)。方法2：将羊抗鼠抗体用包被缓冲液稀释成5 μg/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 μl，4℃过夜，次日用每孔200 μl封闭液封闭30 min，洗涤3次，加入标准血清20 μl、稀释的抗睾酮单克隆抗体50 μl及睾酮-HRP 50 μl(1∶10 000)，孵育、洗涤、检测同方法1。方法3：将睾酮-BSA溶于包被缓冲液中，浓度为10 μg/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 μl，4℃过夜，次日用每孔200 μl封闭液封闭30 min，加入20 μl标准血清及100 μl用分析缓冲液稀释的抗睾酮单克隆抗体，室温孵育60 min，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗鼠抗体，室温孵育30 min，洗涤3次，加发光液，检测同方法1。
2 结果
2.1 3种方法的比较 以B／B0为90%作为检测灵敏度，方法1、方法2和方法3的检测灵敏度分别为0.196、0.063和0.078 ng/ml。
2.2 重复性和准确性 采用方法2，当空白血清中加入1.0、5.0、10.0 ng/ml睾酮检测，批内变异系数分别为7.4%、6.1%和5.8%(n=20)，批间变异系数分别为8.7%、6.6%和6.9%(n=20)，回收率为98.2%～104.0%。
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