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类风湿关节炎患者外周血及滑膜液 型胶原反应性B细胞检测及其特异性分析 |
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y isotype matched anti-HCII antibody in both ELISA and ELISPOT assays. Conclusion:(1)antibody against type Ⅹ collagen in RA patients have pathogenic potential, however, this collagen Ⅹ specific B cell response only can be found in a very sensitive assay and a very sufficient stimulation. (2) CD4+EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA is efficient for activation of CD5+ autoantibody producing cells.
Key words Rheumatoid arthritis Collagen type Ⅹ ELISPOT assay
类风湿关节炎(RA) 是国际范围内的常见病，病因尚不完全清楚，但自从人们发现人体对Ⅱ 型胶原的免疫反应是RA发病机理中的重要因素以来，本病在国内外引起研究者们的极大重视，而且进展相当迅速。
软骨细胞合成的胶原类型是不同软骨细胞不同分化阶段的特殊标志。软骨前体细胞和再分化软骨细胞合成Ⅰ、Ⅲ 型胶原，具有功能活性的透明软骨细胞合成Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原， 肥大软骨细胞已经被明确证实合成Ⅹ型胶原［1］。以往人们研究比较多的是 RA 患者抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型胶原免疫反应，但也有人先后从RA患者血清及滑膜液中检测到抗Ⅸ、Ⅺ型微量胶原抗体［2］,不过Ⅹ型微量胶原是否和Ⅸ、Ⅺ型胶原一样具有免疫原性，是否参与RA 的免疫病理损伤过程还是目前尚不清楚的问题。
本项工作是在我们预先已经观察了RA患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应B细胞频率的基础上［3，4］，把最初由Zubler报道的一个多克隆B细胞刺激系统和由Sedgwick报道的从单细胞水平检测抗体分泌细胞技术结合起来［5，6］，分析了RA患者外周血及滑膜液Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应, 并与骨性关节炎 (OA) 患者进行了比较。
1 材料与方法
1.1 检测对象 RA患者28例，男7例，女21例,年龄45～69岁，平均54岁,病程7个月～20年,平均5.1年。取标本当时15例患者正在服用强的松，所有患者在取关节液前3个月均未接受过关节腔内激素治疗。全部患者类风湿因子阳性并有局部关节严重损伤的CT或X线改变。骨关节炎患者15 例，其中男6例,女9例，年龄48～74岁，平均52岁，病程5个月～7年，平均3.9年。6例患者在取关节液当时正在服用非激素类抗风湿药，全部患者也均有关节局部严重损伤的CT或X线改变。
1.2 试剂和细胞克隆 EL-4胸腺细胞克隆(OUr BUr,RH Zuber教授,Geneva 瑞士),PMA(Sigma,Deisenhofen,德国),rIL-2(Eurocetus Amsterdam,荷兰),PWM(Gibco Eggenstein,德国),抗CD19、CD20、CD5抗体(Dianova Hamberg,德国),重组人Ⅹ型胶原(HCⅩ) 及抗Ⅱ型、Ⅹ型胶原抗体(anti-HCⅡ/anti-HCⅩ)均由von der Mark K教授提供(Erlangen,德国)。
1.3 抗体分泌细胞的产生 Ficoll-Hypaque 梯度离心分离外周血及滑膜液单个核细胞(PBMC及SFMC)，调整细胞浓度2.5×105ml-1，然后以照射后的EL-4 OUr BUr细胞(2.5×105ml-1)、PMA(3 ng/ml)、rIL-2(50 U/ml)进行刺激,6 d后收集细胞通过ELISPOT技术检测（anti-HCⅩ ISC）频率，部分试验于6 d后收集细胞培养上清，通过ELISA检测上清中抗体浓度。
1.4 酶联斑点(ELISPOT）试验 用HCⅩ包板，置4℃过夜，1%BSA封板后将刺激后的PBMC或SFMC加入培养板，37℃ 16 h后洗细胞，加入碱性磷酸酶标记抗人Ig、IgM或IgG抗体，37℃ 2 h后洗板，加入含琼脂的底物溶液（AMP缓冲的BCIP，pH10.25），12 h 后ELISPOT计数仪下通过计数蓝色斑点而计数anti-HCⅩ ISC。
1.5 CD19、CD20、CD15 细胞表型分析 采用间接荧光染色技术用抗CD19、CD20抗体分别染色外周血及滑膜液单个核细胞，用抗CD5抗体染色外周血及滑膜液B淋上一页 [1] [2] [3] 下一页
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