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肝癌TIL细胞转导IL |
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(X)1，从北京军科院引进，于载体BamHI单一位点插入IL-2全长cDNA，构建成PZIP NeoSV.IL-2。
1.3 重组病毒的增殖 采用DNA磷酸钙共沉淀法［2］转染病毒包装细胞PA317，转染细胞经G418(1 mg／ml)选择培养2 w后，扩增G418抗性集落，收获24 h含病毒的培养上清，用NIH3T3细胞测定PA317细胞上清中的病毒滴度。
1.4 肝癌TIL细胞的分离 手术切除的肝癌肿块，在无菌条件下去除肿瘤瘤体表面的坏死组织，将瘤体剪成0.5～1.0 mm3的组织碎块，置于含抗生素的IMDM培养液及磁力搅拌棒的烧杯中，加0.1%胶原酶，0.002%I型DNA酶及0.01%透明质酸酶。在磁力搅拌下，于37℃消化2～6 h，消化后的悬液用100目尼龙网过滤去除未消化的瘤体或细胞团，用Hank′s液洗2次，制得细胞悬液，置于底层比重为1.077的100%淋巴细胞分层液，上层为以IMDM培养液稀释的比重为1.055的70%淋巴细胞分层液的液面上。经2 200 r/min 20 min不连续密度梯度离心后，分别收集淋巴细胞与肿瘤细胞。
1.5 重组病毒感染肝癌TIL细胞 制备的TIL细胞经IL-2培养2～3 w，细胞生长活跃，以3×105细胞／ml置入24孔板内，培养24 h，加入不同稀释倍数含重组病毒的PA317细胞培养上清及终浓度为4 μg／ml的聚凝胺(Sigma公司产品)，10%人AB血清的IMDM培养液中培养24～48 h，G418选择培养2 w，扩增G418抗性集落。
1.6 细胞增殖活性测定及形态学观察 将细胞以5×103/孔的浓度置入96孔板内培养不同时间，用MTT比色法检测细胞增殖活性，并计算倍增时间；用Wright Giemsa原位染色观察细胞形态；CD3、CD4、CD8细胞表型测定，采用间接免疫荧光法。
1.7 转基因TIL细胞杀伤活性与基因表达测定 TIL细胞杀伤活性测定采用3H-TdR释放法，靶细胞为Anip973与K562细胞［3］；IL-2活性测定采用CTLL-2细胞MTT比色法［4］。
2 结果
2.1 基因转导TIL细胞上清中的IL-2活性 基因转导的TIL细胞在不含G418的IMDM中培养不同时间，收获培养上清，用IL-2依赖细胞系CTLL-2以MTT比色法检测IL-2活性，测得的结果，基因转染TIL上清中含有IL-2，活性明显高于转导PZIP NeoSV.(X)1空载体及未转导的肝癌TIL细胞上清IL-2活性，见图1。
图1 转导IL-2基因后TIL细胞培养上清中IL-2水平
Fig.1 IL-2 level secreted by TIL cell after transfered with IL-2 DNA
2.2 细胞形态学、表型、增殖与杀伤活性变化 在倒置显微镜下及用Wright Giemsa原位染色观察基因转导TIL与未转导TIL细胞未见明显形态学改变。将转导IL-2基因TIL细胞与未转导IL-2基因细胞平行培养12 d，观察其增殖、表型分析与杀伤活性测定，转导前与转导后TIL表型与杀伤活性没有明显变化。其增殖活性略低于转导前，见图2。
图2 细胞增殖活性动态观察
Fig.2 Kinetic observation of transduced TIL proliferative activity
3 讨论
本研究结果表明，逆转录病毒载体介导IL-2基因导入肝癌TIL细胞后，外源基因在人肝癌TIL细胞系可获得表达，表达量明显高于未进行基因转导的TIL，且转导后的TIL细胞表型、增殖及杀伤肿瘤细胞活性均未见显著改变。TIL细胞的临床应用开始于80年代中后期，是继LAK细胞疗法之后又一新的杀伤自体肿瘤细胞的过继免疫治疗方法，尤其是TIL具有“回巢”和特异性杀伤肿瘤细胞功能，经基因转导后，TIL能表达IL-2基因产物，但其表达IL-2水平尚不够高，因此获得高表达、高特异性转基因TIL，增强患者机体免疫功能，特异性杀伤循环中游离的癌细胞是十分必要的，也是有待于解决的问题。
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